肝组织内HBVcccDNA含量与肝细胞癌临床和病理相关性分析

肝组织内HBVcccDNA含量与肝细胞癌临床和病理相关性分析

钮志林1高胜利1朱翔2陈少骥3

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吴江第一人民医院感染病科215200

摘要：目的测定肝细胞癌(HCC)癌组织和非癌组织的HBVcccDNA含量，探讨癌组织HBVcccDNA与Hcc的关系。方法采用荧光定量PCR检测45例肝细胞癌患者癌组织和非癌组织中总HBVDNA和HBVcccDNA含量，分析2种组织中HBVcccDNA和总HBVDNA与癌组织病理分级的关系。结果血清HBsAg阳性的癌组织较对应非癌组织总HBVDNA无显著性差异(4.33±1.1vs4.13±1.09，P=0.439)，而癌组织HBVcccDNA水平显著升高(3.09±1.22vs2.62±0.97，P=0.039)，HBVcccDNA所占比例也显著升高(70.09%vs62.33%，P=0.015)；42例中有14例(33%)的癌组织HBVcccDNA几乎成为HBVDNA唯一存在形式；3例血清HBsAg阴性的HCC中均检测到了HBVcccDNA的存在，且HBVcccDNA比例均较高；癌组织和非癌组织HBVcccDNA与组织总HBVDNA均呈正相关(r=0.8244，P＜0.001；r=0.8460，P＜0.001)；癌组织中HBVcccDNA定量和肿瘤的病理分级无明显相关性(P＞0.05)。结论肝癌组织中HBVcccDNA水平和所占比例较非癌组织均升高，HBVcccDNA在肝细胞癌变中有重要的作用，但水平与肝细胞癌的病理分级无明显相关。

关键词：肝细胞癌，HBVcccDNA，HBVDNA

HBV的共价闭合环状DNAcccDNA是HBV生命周期中重要的复制中间体，是病毒mRNA转录模板，也是病毒感染和复制的重要标志[1]，被公认为HBV持续感染和肝脏进行性病理改变的根本原因。我们应用荧光定量PCR方法检测癌组织和非癌组织HBVcccDNA水平，分析其与肝癌病理分级关系，了解HBVcccDNA在HCC中的作用。

1研究对象与方法

1.1研究对象

2012年12月～2013年5月就诊的45例原发性肝癌患者，男36例，女9例。其中42例为血清HBsAg阳性，3例为血清HBsAg阴性，其中2例血清抗HBe和抗HBc均阳性，1例仅抗HBc阳性。血清抗HCV抗体均阴性。所有患者均未进行过抗病毒治疗。HCC诊断均经病理检查证实。癌组织和非癌组织均取自于手术切除标本，非癌组织中均未查到癌细胞。所有标本采集后，部分10%甲醛固定、石蜡包埋、连续切片后行HE染色。其余组织放入-70℃保存备用。

1.2肝组织中HBVcccDNA和总HBVDNA定量VQ.PCR检测HBVcccDNA定量检测试剂盒购于杭州博赛基因诊断技术有限公司，按说明书操作，检测范围是2.5×102～2.5×1011copies/ml。总HBVDNA用荧光定量PCR仪(罗氏公司Lighecycler仪)检测，取检测结果对数值进行统计学分析。

1.3肝癌组织病理学分级按Edmondson分级，其中I级8例，Ⅱ级20例，Ⅲ级12例，Ⅳ级5例。

1.4统计学处理用SPSS16.0软件进行。

2结果

2.1血清HBsAg阳性癌组织和非癌组织内HBVDNA和HBVcccDNA的定量结果

表142例血清HBsAg阳性癌组织和非癌组织中HBVDNA定量水平(±s，log)

3例血清HBsAg阴性的癌组织内HBVDNA和HBVcccDNA定量平均值(±s，log)分别为3.03±0.49和2.52±0.37，非癌组织内HBVDNA和HBVcccDNA定量平均值分别为2.82±0.61和1.81±0.35。此3例癌组织中HBVcccDNA所占比例均高于对应的非癌组织，最高者可达99.52%。

2.2癌和非癌组织中HBVcccDNA与组织HBVDNA定量的相关性，癌组织中HBVcccDNA和HBVDNA定量呈高度正相关，r=0.8244，P＜0.001；非癌组织中HBVcccDNA和HBVDNA定量亦呈高度正相关r=0.8460，P＜0.001。

2.3Hcc组织中HBVcccDNA水平与病理分级的关系无显著的相关性(P＜0.05)。

3讨论

LevreroM等[2]曾用实时PCR技术定量检测癌组织和非癌组织中HBVDNA水平，但该技术不能区分cccDNA和rcDNA，无法了解HBVcccDNA水平和变化。江明凤等[3]设计的嵌合引物检测方法，利用HBVrcDNA和HBVcccDNA分子结构的不同，有效地将两者分开，实现了对cccDNA的特异性检测。

本研究采用此方法，结果显示癌组织中HBVcccDNA水平和HBVcccDNA占总HBVDNA的比例均较非癌组织显著增加，但2种组织的总HBVDNA水平没有显著差别；组织内HBVcccDNA水平和总HBVDNA水平呈高度正相关；癌组织中HBVcccDNA水平与HCC的病理分级无明显相关。与Cheng等[4]用侵入式方法对HCC患者肝癌组织和非肝癌组织HBVcccDNA和总HBVDNA的检测结果一致。本研究中80%的HCC均存在肝硬化，肝硬化是HCC重要的前期病变。逻辑上硬化的非癌组织的HBVcccDNA的水平应比无硬化的慢性肝炎组织高，马艳丽等

[5]同样采用嵌合引物法对48例慢性乙肝患者肝活检组织中HBVcccDNA和总HBVDNA进行了定量检测，慢肝组织中HBVcccDNA水平和本文硬化非癌组织HBVcccDNA水平进行比较后，前者水平明显高于后者，可能随着肝脏的进行性病理改变，病毒常规复制总体逐渐减弱的趋势占据了主导地位。

本研究中癌组织和非癌组织内HBVcccDNA水平与其总HBVDNA水平均呈高度正相关，与慢性乙肝患者肝活检组织中两者相关性的研究结果一致，显示此正相关存在于整个慢性乙肝自然病程中，组织内总HBVDNA水平在一定程度上可以反映组织内HBVcccDNA的水平。

研究表明，抗病毒治疗能显著降低组织内HBVcccDNA水平和HCC的发生[6]。本研究中，包括3例血清HBsAg阴性的HCC在内，癌组织内HBVcccDNA水平和比例均升高，甚至成为唯一存在形式，提示HBVcccDNA在HCC发生过程中起着重要作用。虽然具体机制尚不清楚，但为临床上进行积极的抗病毒治疗而降低肝癌的发生提供了理论依据。

参考文献

[1]Jun-BinS,ZhiC,Wei-QinN,JunF.AquantitativemethodtodetectHBVcccDNAbychimericprimerandreal-timepolymerasechainreaction.JVirolMethods.2003.112(1-2):45-52.

[2]LevreroM,PollicinoT,PetersenJ,BelloniL,RaimondoG,DandriM.ControlofcccDNAfunctioninhepatitisBvirusinfection.JHepatol.2009.51(3):581-92.

[3]江明凤,江培学,陈伟华.乙肝患者血清中HBVcccDNA荧光定量检测方法的优化.中国卫生检验杂志.2010.(04):782-785.

[4]ChengPN,LiuWC,TsaiHW,WuIC,ChangTT,YoungKC.AssociationofintrahepaticcccDNAreductionwiththeimprovementofliverhistologyinchronichepatitisBpatientsreceivingoralantiviralagents.JMedVirol.2011.83(4):602-7.

[5]马艳丽（综述）,任万华（审校）.乙肝病毒cccDNA的研究进展.临床肝胆病杂志.2006.22(3):221-222.

[6]潘爱萍,黄古叶,陈晶,何燕玲.乙型肝炎病毒cccDNA与HBx蛋白在肝细胞性肝癌中表达的关系及意义.世界华人消化杂志.2009.(7):712-715