亚甲蓝光化学法病毒灭活血浆袋及其照射柜的血浆HBV病毒灭活效果

亚甲蓝光化学法病毒灭活血浆袋及其照射柜的血浆HBV病毒灭活效果

曹丽群胡桂兰

曹丽群胡桂兰(黑龙江省鹤岗市人民医院154101)

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2011）37-0118-02

【关键词】亚甲蓝光化学法血液检测病毒性疾病

成分输血在临床上应用日益广泛，尤其是血浆用量日益增大，输血安全口益受到人们重视，对血浆的病毒灭活是保障输血安全的措施之一。在血浆的病毒灭活各方法中，亚甲蓝光化学法的效果已被证实，其病毒滴度减少程度与所用的光照强度和亚甲蓝(MB)浓度有直接关系。亚甲蓝光化学法对经血传播的HBV、HCV、HIV等脂质包膜病毒均有较好的灭活效果。但亚甲蓝光化学法灭活血浆病毒的效果受到各因素如光照时间、光照强度、血浆量及亚甲蓝浓度等影响。于是在应用亚甲蓝光化学法设计相关产品时会受到上述各种因素的制约。目前将此法应用到血浆袋的报道极少。本研究采用以亚甲蓝光化学法设计的血浆病毒灭活剂过滤血浆袋及配套使用的血液照射柜，将亚甲蓝光化学法灭活病毒过程中的各步骤规范化、整体化、标准化，消除了病毒灭活过程中隐含的各种干扰因素，从而找到了一条将亚甲蓝光化学法应用于血浆袋的有效途径。

1材料与方法

1.1材料与仪器

病毒灭活剂(亚甲蓝)过滤血浆袋(WG-BM100，5套，生产批号：20060321，威海高分了材料公司)；血液照射柜WG-BM(照度50000Lux，威海高分子材料公司)；威海市中心血站采集已鉴定为乙肝阳性病人的血液，并分离血浆(每袋100ml，共5袋)；荧光定量PCR检测仪(型号码ABIprism-7000)；HBV-DNA荧光定量PCR榆测试剂(由中山大学达安基因股分有限公司提供，批号20060412)；Eppendorf管(EP管)。

1.2方法

1.2.1标本病毒灭活将装有已鉴定为乙肝阳性病人血浆的血浆袋浸入75%的酒精溶液30min进行表面消毒后，移至超净工作台内，取样200ul于EP管内保存，作为光照前的病毒标本。在超净工作台内，将留样管封口，同时打开病毒灭活剂过滤血浆袋，用插袋针刺破装有血浆袋插口，将血.浆袋高搁，使袋内的血浆流经加药器完全进入病毒灭活剂过滤血浆袋，打开血液照射柜制冷开关，使血液照射仪内的温度显示为4摄氏度。将病毒灭活剂过滤血浆袋放入血液照射仪内进行照射，每隔5、10、30min在超净工作台内取200ul样本放入EP管内，待检测。

1.2.2HBV—DNA检测

1.2.2.1标本处理取血浆标本40ul，加等量DNA提取液打匀，100摄氏度电热恒温金属浴10min(误差不超过1分钟)，10000rpm离心5min，取上清液2ul做PCR反应。

1.2.2.2PCR扩增取HBV-PCR反应管，分别加入处理后样品、阴阳性质控品和阳性梯度各2ul，6000rpm离心1分钟。将各反应管放入定量PCR仪器的孔反应槽内，按对应顺序设置阴、阳性质控品，阳性定量质控标准品梯度以及未知标本，并设置样品名称，检查循环条件：93摄氏度一2分钟预变性，然后按93摄氏度45秒-55摄氏度60秒，先做10个循环，然后按93摄氏秒-55摄氏度45秒，做30个循环。

1.2.2.3结果分析条件设定反应结束后保存检测数据文件。根据分析后图像调节baselibne的start值(2-4)，stop值(7-9)以及Threshold值，使stdcurve窗口下的标准曲线图达到最佳，cowelmion数值介于(-0.97)——(-1)之间。最后记录仪器自动分析计算出未知标本数值。

1.2.3统计学处理

所得结果以均值±标准差表示，采用X2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1标本病毒灭活前后血浆HBV—DNA浓度结果见表1

表1标本病毒灭活前后血浆HBV—DNA载量(COPY/ml)

注：P<0.05

5袋血浆标本在未光照时HB～一DNA浓度分别为4.9×104、4.7×104、5.6×103、3.4×10s、4.7×106(COPY/ml)，经光照后随时间延长(5、10、15、30min)HBV—DNA浓度逐渐降低，30min后浓度均下降为<1000(COPY/ml)，其中样品1和样品2起始浓度在所有样品中最低，该样品病毒被灭活时间最短，仅有15mim。

2.2标本HBV灭活的动力学曲线如图1

将灭活前血浆HBV-DNA浓度作为100%，灭活不同时间血浆中残留的HBV-DNA浓度的比值以百分数表示作为纵坐标，以不同光照时间作为横坐标，绘制病毒灭活的动力学曲线。

结果显示，病毒灭活并不是匀速过程，光照5min内浓度下降最快，达到起始浓度的20%以下，随着照射时间的延长，残留HBV-DNA的浓度逐渐下降，但下降速度减慢，30min后血浆DNA浓度下降接近0%。

3讨论

我国是乙型肝炎的高发区，特别是东部沿海和长江以南地区，而且感染人群主要分布在10-14岁和30-35岁两个年龄组。据统计我国人群HBV感染率平均9.75%。目前我国临床输血来源主要为人群的无偿献血，如此高的HBV人群感染率使得人们虽然在献血，之前都要经过严格的检查程序，但仍不能保证血站采的血源100%不含有HBV病毒，并且血.站在对血样进行成分处理时也不能保证其100%不受HBC污染。与HBV病毒作斗争，遏制HBV在我国的流行传播是很艰巨的任务，控制血浆制品输血过程中HBV的传播是其中很重要的一条途径。本研究为临床血浆HBV的清除展示了很好的方法，并且本研究中的病毒灭活是血浆病毒处理的最后一道工序，它与血站务液采集过程中人群HBV检测，构成了血浆制品HBV传播遏制的双保险，对临床血浆制备和输血工作具有重大意义。

亚甲蓝是一种酚噻嗪类染料，是一种光敏剂。光敏剂可在光照条件下产生单线态氧或白由基，氧化损伤病毒的分子结构，从而杀灭病毒。各种光敏剂的作用特点不尽相同，如补内脂内脂衍生物主要产生自由基，酞菁类光敏剂主要产生单线太氧，而亚甲监在病毒灭活方面具有良好优势。

目前理论研究证实亚甲蓝光化学法还有局限性：一是只能灭活脂包膜病毒，如HBV、HCV、HIV等，对有些非脂包膜病毒如HAV、B19等病毒不敏感，二是对细胞内病毒灭活效果不理想，三是光化学作用对细胞膜有损伤。三研究将亚甲蓝光化学法应用于病毒灭活剂过滤血浆袋，仅证实了在血浆中HBV灭活的有效性，验证了在血浆袋中亚甲蓝光化学法对脂包膜病毒原理的正确性，它是否有用于其他脂包膜病毒如HIV、HCV等灭活，有待于进一步研究；此法能否应用于红细胞等血细胞制品中的病毒灭活，应用于杀灭HAV等非脂包膜病毒还需要相关理论的进一步突破。

亚甲蓝在对病毒进行有效杀灭的同时，其产生的自由基和单线态氧也可能会对血浆中许多有用成分产生影响，如对凝血因子的损伤，所以该法在应用于血浆袋时还需要考虑对血浆中有用成分的保护，以免血浆中有价值的成分丧失，保证血浆的质量。因此该血浆袋还需作进一步研究，验证血浆病毒灭活后是否对血浆中有用成分如凝血因子及纤维蛋白原含量有影响，验证血浆质量是否降低。本研究所设计的血浆袋和血液照射仪，提供了血浆制品病毒灭活的方便、经济、安全、有效的途径，对实现安全输血，提高人民群众的健康水平有巨人的社会效益。亚甲蓝光化学法具有的独特优势使该法在输血、生物制品的病毒灭活领域的应用和相关产品开发逐渐兴起。

亚甲蓝在临床上是常用的解毒剂，主要用于治疗亚硝酸盐和氰化物中毒，治疗剂量通常需要每天维持在1-2mg/kg(治疗亚硝酸盐中毒)和5-10mg/kg(治疗氧化物中毒)，副作用较小。并且灭活500ml血浆所用亚甲蓝量是治疗亚硝酸盐中毒用量的1.25%，所以在病毒灭活中的亚甲蓝用量是极其微量的，本研究血浆袋中亚甲蓝用量为3mg，成年人每天耐受量100-150mg每曰，这么微量的亚甲蓝显然很难引起临床副作用，那么该法设计的血浆袋中的亚甲蓝在血浆输血时是安全的。

本研究以亚甲蓝光化学法设计的血浆袋和配套使用的血浆照射仪进行病毒灭活，在光照30min后，即可使HBV-DNA含量<1000拷贝/ml，据动力学曲线显示，30min可使HBV—DNA百分率下降95%以上，说明该法在血浆袋中病毒灭活确实有显著效果。

参考文献

[1]钱开诚.血液成分病毒灭活研究的进展[J].中国输血杂志,2004,17(增刊)：36.

[2]黄宇闻，钱开诚.荧光与亚甲蓝联用对血浆中病毒灭活的研究[J].中国消毒学杂志,2000,17(1)：1.