低浓度异氟醚吸入对小鼠生殖生理的影响

低浓度异氟醚吸入对小鼠生殖生理的影响

王龙才1张岩2张成明1舒蕤1

王龙才1张岩2张成明1舒蕤1

（1潍坊医学院山东潍坊261053；2潍坊医学院附属医院山东潍坊261053）

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）4-0085-03

【摘要】目的本实验通过观测不同浓度异氟醚对激素诱导下小鼠排卵的影响，麻醉气体对小鼠妊娠的影响，观测异氟醚对细胞间粘附分子-1、MMP-9的影响，进而探讨麻醉气体对小鼠生殖的影响。方法长期低浓度异氟醚吸入。激素诱导后，采用镜下压片法计数小鼠排卵数。解剖孕18天小鼠观察产仔数、幼仔体重、身长。采用免疫组织化学检测小鼠子宫内膜中细胞间粘附分子-1、MMP-9的表达。结果吸入不同浓度异氟醚的小鼠排卵数与对照组之间的差异无统计学意义（P>0.05）。吸入0.1%异氟醚的小鼠妊娠产仔数与对照组相比数量下降（P<0.05），小鼠幼仔体重身长与对照组相比无差异（P>0.05）。免疫组织化学检测显示吸入异氟醚组子宫内膜中细胞间粘附分子-1、MMP-9的表达少于对照组（P<0.05）。

【关键词】异氟醚生殖免疫组化细胞间粘附分子-1MMP-9

本研究通过模拟手术室中低浓度麻醉废气,观测低浓度麻醉气体对女性生殖系统的影响,并探讨其产生地机制。

1材料和方法

1.1实验动物六周龄昆明小鼠（山东中医药大学动物实验中心提供）。

1.2主要试剂和材料异氟醚、孕马血清促性腺激素、绒毛膜促性腺激素、免疫组织化学试剂及药品。

2方法

2.1采用统计软件SAS9.02进行随机化，将40只六周龄雌性小鼠随机分为ABCDE组。将ABCD四组小鼠分别置入体积1.5m2，底部垫有钠石灰的密闭箱内。根据吸入麻醉药的理化性质（每毫升液态异氟醚可产生196ml气体）计算出保持箱内异氟醚浓度为0.003%0.03%0.06%0.1%所需液态异氟醚的量，并用注射器抽取异氟醚注入放有小鼠的密闭箱内。每天让ABCD四组小鼠分别吸入上述浓度异氟醚8小时。E组放入无麻醉气体的同种箱中每天8小时。持续30天后，于16时腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG)10U/只，48小时后腹腔注射绒毛膜促性腺激素（HCG）10U/只。HCG注射后次日9-10时脱颈椎处死小鼠，剖腹取出双侧输卵管、子宫及卵巢，放入盛有少量生理盐水的培养皿中。在解剖显微镜下分离出输卵管，用压片法将输卵管壶腹部压平展开。在显微镜下观察输卵管壶腹中的卵母细胞，计数并记录。

2.2将六周龄昆明雌性小鼠16只分为实验组和对照组。实验组小鼠在与性成熟雄鼠合笼前30天开始吸入0.1%异氟醚。对照组除不吸入异氟醚外其他饲养条件同实验组。30天后雌雄小鼠按1：1合笼。合笼后于每日晨6时观察阴栓，出现阴栓计为孕0.5天。孕后继续吸入0.1%异氟醚至孕18天。剖腹取出胚胎和子宫，检查胚胎有无畸形异常，计数胚胎数量。使用电子称称量鼠仔体重，使用游标卡尺测量鼠仔体长并记录。

2.3将六周龄雌性昆明小鼠16只分为实验组和对照组。实验组小鼠在与性成熟雄鼠合笼前30天开始吸入0.1%异氟醚。对照组除不吸入异氟醚外其他饲养条件同实验组。30天后雌雄小鼠按1：1合笼。合笼后于每日晨6时观察阴栓，出现阴栓计为孕0.5天。孕后继续吸入0.1%异氟醚至孕5.5天。剖腹取出小鼠子宫，将组织置于10%中性甲醛固定24-48小时。严格按照免疫组织化学ElivisionTM法染色具体步骤如下：1，组织从固定液中取出，流水冲洗1-2小时。2，脱水：70%酒精—80%酒精—95%Ⅰ—95%Ⅱ—无水乙醇Ⅰ—无水乙醇Ⅱ，各浓度酒精浸泡30min—1h。3，透明：彻底脱水后的组织经二甲苯Ⅰ—二甲苯Ⅱ，各浸泡30min。4,浸蜡：完全透明的组织放入56—58摄氏度石蜡中2—3h.5，包埋：被切面向下包埋于石蜡中，冷却后成蜡块。（常温保存）6，切片：旋转式切片机将石蜡切成5—10um薄片，贴在铬矾胶处理的载玻片上。7,,58—60摄氏度烤片2—4小时。8，脱蜡入水，二甲苯Ⅰ20min—二甲苯Ⅱ20min—无水乙醇Ⅰ10min—无水乙醇Ⅱ10min—95%乙醇Ⅰ5min—95%乙醇Ⅱ5min—80%乙醇3min—70%乙醇3min—蒸馏水5min,9，免疫组织化学染色：3%H2O2离子水孵育15min，0.01mPBS冲洗，5min×3min。柠檬酸盐抗原修复（92—96℃，15min,低火），PBS冲洗，5min×3次。滴加一抗，室温1—2h∥4℃过夜，PBS冲洗，5min×3次。滴加试剂1，室温10—20min(15min),PBS冲洗，5min×3次。滴加试剂2，室温10—20min(15min),PBS冲洗，5min×3次。DAB显色：双蒸水1ml＋A混匀，然后加B，C各一滴，再次混匀，避光保存，30min内使用。自来水冲洗。复染。

2.4统计学处理，所有数据应用SPSS16.0统计软件进行统计分析，所有数据用均数±标准差（x-±s）表示,采用单因素方差分析。免疫组化切片采用CMIAS多功能真彩图像分析仪器进行分析，用医学彩色图像分析系统测阳性反应物的平均积分光密度值，实验组和对照组各选64个视野（8只小鼠每只取两张切片，每张切片取4个视野）分别测量，然后计算光密度值的均数作为实验组和对照组的代表值。

3结果

3.1低浓度异氟醚吸入对雌性小鼠排卵数的影响

低浓度吸入0.003%0.03%0.06%0.1%的异氟醚30天后压片法计数显示吸入异氟醚的四组小鼠排卵数与空白对照组相比无显著变化。差异无统计学意义（P>0.05）。(见图1表1）

表130只小鼠左右卵巢排卵数

图2

3.3低浓度吸入异氟醚对小鼠子宫内膜上皮细胞分泌细胞间粘附分子-1、MMP-9的影响

实验组吸入0.1%异氟醚30天后，妊娠5.5天小鼠子宫内膜分泌的细胞间粘附分子-1、MMP-9免疫组化显示阳性产物呈棕黄色颗粒状，主要分布于子宫内膜上皮细胞胞质内，血管上皮细胞内也有阳性表达。但与对照组相比实验组细胞间粘附分子-1、MMP-9的表达量减少。差异有统计学意义（P<0.05）（见图3，表3）

4讨论

职业环境中许多化学物质具有生殖损伤效应，不仅影响女工自身健康，同时对后代的健康造成潜在的危害。大量的流行病学研究资料显示，长期暴露于吸入麻醉废气环境中的女性工作者，其自然流产率及畸胎出生率显著高于不接触吸入麻醉废气的妇女。

在本研究中，低浓度异氟醚对雌性小鼠排卵数无显著影响。0.1%异氟醚吸入组小鼠妊娠产仔数与对照组相比减少（P<0.05）。鼠仔的体重身长与对照组相比无显著差异（P>0.05）。免疫组织化学显示，吸入低浓度异氟醚孕4.5天小鼠子宫内膜中ICAM-1和MMP-9的表达少于对照组（P<0.05）。ICAM-1是一种重要的整合素。可见，低浓度异氟醚吸入造成实验组小鼠胎产仔数减少，产生机制之一是低浓度异氟醚抑制子宫内膜中ICAM-1与MMP-9等的合成，其合成的减少抑制小鼠囊胚发育率及胚泡植入，影响受精卵着床使受孕率显著下降。