细胞图像DNA定量分析技术取代常规细胞应用于湘西北地区宫颈癌初筛可行性分析

细胞图像DNA定量分析技术取代常规细胞应用于湘西北地区宫颈癌初筛可行性分析

王江涛1聂长庆1杨利铭1胡丹妮1孙小年1王

1．常德市第一人民医院湖南常德415000；2麦克奥迪医疗诊断系统有限公司武汉430000

【摘要】目的：探讨细胞图像DNA定量技术（DNA倍体分析）对湘西北人群宫颈癌初筛，以提高局部地区宫颈癌临床早期诊断率可行性研究。方法：对参与宫颈癌筛查临床试验的6600例湘西北地区本地入组患者均同时采用宫颈刷取物行常规诊断细胞学、DNA倍体分析两种方法的检查，分析比较两种方法在宫颈癌筛查中诊断效果的异同，并给出进一步治疗或随访建议。结果：两种方法比较，DNA倍体分析的诊断敏感性（阳性率5.30%）高于常规细胞学（2.39%）；两种方法诊断结果的实际一致率为87%，κ值0.40；并且发现，两种方法筛查阳性率随年龄增长而有显著增高，活检受检者中≥50岁的宫颈癌及癌前病变的罹患率显著提高，提示50岁为临床宫颈癌高发年龄，应作为宫颈早期诊断的重要筛查对象。结论：细胞图像DNA定量技术在宫颈癌早期筛查中具有重要的应用价值，可作为一种重要的筛查手段在经济欠发达地区取代常规细胞学普及使用。

【关键词】宫颈癌筛查，细胞图像DNA定量技术，常规细胞学

DNAquantitativeanalysisofcellimagetoreplaceconventionalcytologyintheprimaryscreeningofcervicalcancerinthenorthwestofHunanProvince

WangJiangtao1NieChangqing1YangLiming1HuDanni1SunXiaonian1WangLiying1NieKun2

1FirstPeople'sHospitalofChangdeCity，Hunanprovince，Changde415000，China

2MikeAudiMedicalDiagnosisSystemCo.，Ltd.Wuhan430000，China

Abstract：PurposeToexploretheeffectofDNA-ICM（a.k.a.DNA-ploidyanalysis）incervicallesionscreeninginnorthwestofHunanprovince.METHODS6600slidesofcervicalcytologypreparationswerescreenedbyusingconventionalcytologyandDNA-ploidyanalysis.Compareandcombinetwomethodsinscreening.RESULTSthepositiverateofDNA-ploidyanalysisishigherthanconventionalcytology（5.30%vs.2.39%），theobservedagreementbetweenDNA-ploidyandcytologyissufficient（87%），andκvalueis0.40，impliesthatbothtwomethodshaveconsistency.Andnegativeratewouldgoupastheageofwomenincreased.EspeciallytherateofcervicalcancerandCINinover50year-oldwomensignificantlyincreased.CONCLUSIONDNA-ICMcansupplyimportantinformationincervicallesionscreeningandservedasanenhancedtoolincervicalcancerdiagnosis.

KEYWORDS：CervicalCancerScreening，DNA-ICM，ConventionalCytology

1.研究背景

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，严重影响妇女身心健康与生活质量。其原位癌高发年龄国内为30～35岁，浸润癌为45～55岁，而且近年来其发病有明显年轻化的趋势[ElliotP1987，章文华1999]。得益于近几十年宫颈细胞学筛查的大范围应用，使宫颈癌和癌前病变早期发现和治疗率明显提高，宫颈癌的发病率和死亡率也随之逐渐下降。然而，由于受经济条件、病理诊断条件等因素的限制，国内目前依旧有很大部分地区没有开展由政府统一组织的大规模宫颈癌普查。因此，进一步了解研究宫颈癌在我国不同地区的发病、发展趋势，对正确评估宫颈癌在我国的发病状况、发展宫颈癌的防治提供有力依据有积极意义。

湖南地区的少数民族有土家族、苗族、侗族、瑶族、白族等43个少数民族，主要聚居在湘西北土家族苗族自治州，以及怀化市、张家界市、邵阳市等所辖县乡地区，占全省总人口的10%左右[葛晓舒2015]。近20年来我国各自治州子宫颈癌发病总人数呈持续增加趋势，不同民族又各有其分布特点。就发病年龄分析，苗族女性宫颈癌好发年龄呈逐渐年轻化趋势，其中<35岁的年轻患者在患者总数的占比逐年上升，相比较而言，≥65岁子宫颈癌患者的构成比却逐年下降；而土家族妇女宫颈癌高发年龄一直波动在45～55岁，≥65岁的患者比率维持在4%～6%之间[谷海燕2008]。而就宫颈癌具体分型统计时发现，苗族妇女中腺癌所占比例逐年上升，而土家族妇女则维持在7%～8%水平。在对湘西少数民族贫困地区的一次妇科病普查中，虽然发现接受普查的人数逐年增加，但是总体检查率仍然很低，5年间妇科病患病率显著增长。其中，宫颈炎、阴道炎和乳腺增生的患病率升高；尖锐湿疣的患病率有下降趋势，而宫颈癌和乳腺癌的患病率均呈逐年上升趋势[谷海燕2011]。因此，在湘西北地区施行大规模宫颈癌及早期病变的筛查工作势在必行。

目前，宫颈癌早期筛查项目基本上还是围绕基于巴氏涂片的宫颈细胞学诊断，但该项检测所需的高昂的基础设施与人力投入，使之成为在贫困地区进行大规模筛查的一个障碍。故目前关于宫颈癌筛查的研究集中在低投入的新方法上。

近年发展起来的细胞图像DNA倍体分析是一种使用简便、资源投入较少的半自动化细胞病理图像分析技术。其敏感性、特异性等诊断评价指标与常规细胞学、HPV检测等具有明显的可比性[Follen2001，MartialGuillaud2006]。基于此，本研究初步考察了DNA倍体分析技术在经济欠发达地区宫颈癌筛查的应用情况，并与常规细胞学的检测一致性进行了分析，并对一部分诊断阳性者进行了阴道镜活检，分析了阳性病例的诊断准确性。

2材料与方法

2.1受检者及细胞学标本

本研究所使用的细胞学标本以2012年3月至2015年12月自愿参与宫颈癌筛查的临床试验入组适龄女性患者为主，同时兼加同时间段内我院妇产科门诊及体检中心女性受检者。患者来源绝大部分为湘西北地区（湖南省以常德市为中心的益阳市、张家界市、岳阳市、湘西自治州等地市）的常住居民。本研究为随机开放临床研究，共检查了6600例患者标本，年龄跨度为20-85岁，中位年龄41岁。要求入选的患者有2年及以上性生活史的女性，未使用避孕药及其它类固醇类药物，处月经期、妊娠期和哺乳期妇女以及已确诊有其他肿瘤患者或其他不适宜做宫颈脱落细胞学检查者，不列入筛查对象。

每位受检者在常规妇检过程中用专用灭菌的宫颈刷刷取宫颈黏膜细胞[张黎，2010]，立即保存在特制的细胞保存液中，保存后的每份标本取6ml离心后，取细胞沉淀分别制2张细胞薄层涂片，其中一张行巴氏染色供细胞学诊断使用，另一张供DNA染色使用。每人份标本均使用手工滴片法（麦克奥迪医疗诊断系统有限公司技术提供）制片，同时用常规诊断细胞学检查以及DNA倍体分析两种方法进行检测。

2.2细胞学诊断说明

行巴氏染色的细胞薄层涂片经有经验的细胞学医生进行诊断，依据TBS宫颈细胞学报告系统报告诊断结果[SolomonD，2004]，同时根据预后将诊断结果分为三类：1.TBS阳性：包括TBS诊断报告为HSIL、LSIL、ASC-H者；2.TBS可疑：包括TBS诊断报告为ASCUS者；3.TBS阴性：包括TBS诊断报告为NILM者。细胞学诊断与DNA-ICM诊断彼此独立进行以避免相互影响造成的偏倚，同时剔除了那些因上皮细胞数量过少、有血液或炎性细胞覆盖、无明确标识、制片染色不满意等不符合检测质量的标本。

2.3全自动细胞DNA分析技术及诊断说明

DNA染色使用DNA定量试剂盒（麦克奥迪医疗诊断系统有限公司，厦门）提供的温控Feulgen染色法。将标本先进行10%福尔马林缓冲液固定，然后用5NHCl在27℃水解1小时，接着使用Feulgen染液染色1小时[TezcanA，1993]，蒸馏水漂洗15分钟。DNA染色后的切片随后使用DNA-imageCytometry系统（麦克奥迪医疗诊断系统有限公司，厦门）上行DNA倍体检测。DNA-imageCytometry系统硬件由显微镜、高分辨摄像头、微型计算机等组成，可以操控细胞自动分类、倍体测量及异倍体分析。分析软件，即MoticSavant图像处理系统（图1）由加拿大温哥华的BCCA肿瘤研究所研发而成[MartialGuillaud2006]。仪器CV（小于5%）的校准通过鼠肝细胞来完成。检测过程遵从相关试验指南进行[AlfredB?cking1995][G.Haroske2001]。每张切片至少扫描8000个细胞核形成核图像，然后分析软件根据核图像的形态、纹理特征、DNA含量等将其自动自动划分为上皮细胞、淋巴细胞、中性粒细胞及异常细胞几个类别。其中标本至少要有200个上皮细胞核图像成功扫描才能视为符合检测要求，否则视为不满意标本予以排除。仪器CV（小于5%）的校准通过鼠肝细胞来完成。检测过程遵从相关试验指南进行[AlfredB?cking1995][G.Haroske2001]。通过测定每个细胞核的IOD（integratedopticaldensity）来判断细胞核的含量，将DNA含量的大小描述为DNA-Index（DI值），一般正常二倍体细胞（G0/G1期细胞）DI值在1附近（1.9~2.1），增殖细胞（处于S期细胞）的DI值在1.1-1.9之间。DNA倍体检测操作者单盲（不知晓常规细胞学的诊断结果）的情形下进行DNA-ICM诊断。

图1基于DNA倍体分析的MoticSavant细胞图像处理系统的分析诊断界面

我们根据检测到的异常细胞的DI值及异常细胞个数来做DNA-ICM检测的诊断，诊断结果分为三级：1.DNA阳性：DI≥2.5的异常细胞个数≥3个[孟芝兰2011]，或增殖细胞比例大于细胞总数的10%，或出现可疑细胞干系（DI在1.1~1.8或2.2~）[NguyenVQ2004]；2.可疑：DI≥2.5的异常细胞个数1~2个，或增殖细胞比例在5%~10%之间；3.阴性：未见DI>2.5的异常细胞及可疑干系。在此基础上对病例所做的诊断进行计数分析。

2.4宫颈组织病理检查

凡液基细胞学检查为ASC-H以上或DNA倍体分析为可见大量DNA倍体异常细胞的病例，均建议阴道镜下进行常规宫颈3、6、9、12点和宫颈管活检，或者碘试验浅着色区和宫颈管活检。活检组织以4%福尔马林液体固定后，进行取材、脱水、包埋后制片。每例活检标本切片均由2位高年资病理医师做出病理诊断。按组织病理结果，以各项诊断描述中级别最高者作为该病例组织学最后诊断，因此将患者分为慢性炎症、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宫颈癌等。以CINⅠ及其以上级别病变视为宫颈癌及其癌前病变确诊患病者。

2.5统计分析设计

为了评价DNA-ICM系统是否可替代常规细胞学诊断，我们对两种方法诊断结果进行平行效度的评价，方法是：将常规细胞学与DNA倍体分析的“阳性”、“可疑”、“阴性”三种诊断结果进行比对，计算实际一致率、一致性指数κ，并做一致性假设检验（χ2）判断二者之间的一致性大小。同期分析两种检测阳性病例中活检确诊率的不同，以评价两种检测方法是否存在确诊率的差异。并且根据筛查资料，分析常规细胞学联合DNA倍体分析宫颈癌及其癌前病变阳性诊断病例在不同年龄段的分布情况，并在活检病例中分析宫颈癌及其癌前病变的年龄分布情况以得出日后大规模普及筛查最适宜的目标人群。Stata12.0软件协助统计分析。

3结果

6600例受检者中，常规细胞学诊断阳性病例158例（2.39%），分别为“高级别鳞状上皮内病变”（HSIL）6例（0.09%），“低级别鳞状上皮内病变”（LSIL）144例（2.18%），“不除外高级别鳞状上皮内病变的非典型鳞状细胞（ASC-H）”8例（0.12）；可疑病例252例（3.82%），即“意义不明确的非典型鳞状细胞（ASC-US）”；其余为阴性病例6190例（93.79%），诊断报告为“未见上皮内病变或恶性病变（NILM）”，其中2例有微生物感染。

图3各年龄段活检确诊结果的分布示意图

≥20岁不同年龄阶段220例活检结果的分布情况见表7与图2，发现20-40岁受检妇女出现宫颈癌前病变的比率相当，40-50岁开始出现2例恶性肿瘤（鳞癌I级），50岁以后是恶性肿瘤的高发年龄，本次活检的该年龄段人群的中确诊癌症者占25%。

4.讨论

HPV疫苗诞生后对于新发宫颈癌有不可估量的预防意义，但鉴于其在世界上不同地域的应用以及效果的考察任重而道远，对于开始有性生活的适龄妇女施行宫颈癌早期预防性筛查意义仍然非常重大。尤其在偏远、经济欠发达地区，选择合适的手段进行筛查，往往能起到事半功倍的效果[SankaranarayananR2005]。本文考察了DNA倍体分析技术湘西北地区宫颈癌筛查项目中的应用情况，利用该技术诊断的阳性病例的确可有效筛检出CIN甚至宫颈癌患者（确诊率37.9%），且与细胞学差异不显著。通过与常规细胞学检测结果的比对，两种诊断方法具有一定的一致性，说明DNA倍体分析技术层面上对于常规细胞学具有替代性。考虑到该技术对于人力、设备资源投入成本不高，可初步认为其对于湘西北地区宫颈癌筛查项目的开展发挥了有利的作用。

常规宫颈细胞学在宫颈癌早期诊断的应用除了高资源配置的问题以外，还存在敏感性相对较低、漏诊率偏高的问题。BCCA（加拿大不列颠哥伦比亚肿瘤研究院）的研究指出[MartialGuillaud2006]，40%的宫颈癌患者是曾经参加过常规筛查的妇女。本文的研究也发现TBS诊断ASCUS的62例中20例均活检证实为CINⅡ以上患者，甚而TBS诊断NILM的56例中14例被活检证实为CINⅠ以上患者，CINⅡ以上漏诊率达37%-42%。由此说明筛查项目亟待敏感性更高的检测手段将潜在的罹患宫颈癌患者及时检出。我们认为，DNA倍体分析技术将在该领域发挥一定的作用，这方面的研究尚在进行之中。

流行病学及实验研究，证实HPV感染是宫颈癌的重要致病原因之一，尤其是高危型HPV[ClavelC2001]。多数感染可自行消退，只有一小部分最终发展为宫颈癌，且需要相当长的一段潜伏期。因此，利用常规细胞学与DNA倍体分析技术进行宫颈癌的早期筛查将对病例的有效分流发挥重要作用。尤其在不同年龄段的疾病构成比上，我们发现40岁以后浸润性宫颈癌的患病率显著提高，50-60岁达到一个高峰，说明对于女性HPV感染后仍旧每年进行高灵敏度的细胞学-DNA倍体联合诊断的筛查对于监控疾病进展有重要意义。

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基金项目：国家卫生计生委医药卫生科技发展研究中心项目（W2012GJ07）