CD164在胶质瘤细胞上皮间质转化中的作用

CD164在胶质瘤细胞上皮间质转化中的作用

陈勇李志峰童仲驰周仁辉张飞翔黎建先

（岳阳市二人民医院神经外科湖南岳阳414000）

摘要：目的分析CD164在胶质瘤组织及细胞系中的相对表达水平，以及CD164对胶质瘤细胞上皮间质转化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）中的作用及其作用机制。方法采用westernblot检测CD164在45例胶质瘤组织和癌旁正常组织中的表达水平；利用westernblot检测CD164在胶质瘤细胞及人正常胶质细胞中的表达；构建沉默CD164的慢病毒载体，并将其感染至胶质瘤细胞株U251，Transwell实验检测细胞侵袭；westernblot法检测瞬转CD164shRNA后对CD164蛋白表达的影响。结果CD164在胶质瘤组织的表达较正常脑组织显著上调，差异有统计学（P<0.001）；与NHA细胞相比较，CD164在人胶质瘤细胞系SF295、SHG-44、U87和U251细胞中的表达量明显增加，具有明显的统计学差异性（P<0.001）；U251细胞感染CD164shRNA后可抑制U251细胞侵袭。结论CD164在胶质瘤组织和细胞系中的表达均显著上调，CD164与胶质瘤细胞EMT明显相关。

关键词：胶质瘤；CD164；EMT

TheeffectofCD164intheregulationofEMTinglioma

Zhifeng-Li，YongChen，Zhongchi-Tong，Renhui-Zhou，Feixiang-Zhang，Jianxian-Li

Neurosurgery，TheSecondPeopleHospitalofYueyang，Yueyang，Hunan，China，414000

[ABSTRACT]AIM：ToelucidatetherelativelevelofCD164ingliomatissuesandcelllineaswellastheeffectofCD164ontheEMTofgliomacellsinvitro.

METHODS：Quantitativereverse-transcriptionpolymerasechainreaction（qRT-PCR）andwesternblotwereusedtoassesstherelativelevelofCD164ingliomacelltissuesandinvitrocelllines，respectively.HumanCD164sequencewasusedforthedesignofshRNAtargetingCD164，whichwasthenintroducedtolentivirus，followedbytransfectionintoU251cells.Thecellinvasionwasevaluatedbymatrigelcountingassay.

RESULTS：TheexpressionofCD164issignificantlyup-regulatedingliomatissuesamplesandcelllines.ThecellinvasionwasinhibitedsignificantlyaftertransfectionofCD164shRNAinU251cells.

CONCLUSIONS：TheexpressionofCD164isclearlyassociatedwiththeinvasionofgliomacells，whilstCD164maybeusedasapotentialtherapeutictargetforthetreatmentofrectalcancerinthefuture.

[KEYWORDS]glioma；CD164；EMT

恶性肿瘤的主要特征是浸润和转移，肿瘤转移是一个复杂、多因素的级联反应过程，而肿瘤细胞上皮-间质转化的动态转换是肿瘤细胞转移过程中非常重要的步骤[1，2]。CD164作为一种定位于6号染色体的唾液酸黏蛋白[3]。研究表明CD164在机体造血和调节正常细胞生长分化过程中发挥一定调控作用；CD164已经被证实在结肠癌、宫颈癌和成神经管细胞瘤等实体肿瘤发生和发展过程中发挥着重要作用[4-6]；最新研究结果表明CD164可作为急性成淋巴细胞性白血病中分子生物学标记[7]。但CD164在胶质瘤中的表达和作用尚不明确，仍待进一步研究。为此，本次研究拟分析CD164在胶质瘤组织和体外细胞中的表达，同时进一步研究其对体外胶质瘤细胞EMT的影响，探讨CD164对胶质瘤发生发展的生物学意义。

1材料与方法

1.1组织标本

收集岳阳市二人民医院神经外科在2012年6月至2014年6月期间收治的45例脑胶质瘤患者的临床标本，男性患者共有22例，女性患者共有23例，年龄在48.9岁至71.2岁之间，平均年龄为58.6±6.4岁，另外设立5例脑损伤患者正常脑组织标本作为对照。

1.2试剂

Opti-MEM培养基、DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司；Trizol试剂和Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒和细胞蛋白提取试剂盒购自日本TaKaRa株式会社；shRNANC和CD164shRNA购自中国GenePharma；ECMatrix胶和Transwell小室购自美国BD公司；CD164和β-actin抗体购自美国Epitomics公司。

1.3细胞培养

人胚肾细胞株HEK-293T、胶质瘤细胞株SF295、SHG-44、U251和U251及人正常胶质细胞NHA细胞均由上海细胞生物研究所提供。细胞培养于DMEM培养基中，培养基中补充10%胎牛血清、青霉素（100U/μl）和链霉素（100μg/ml）。细胞在37℃且CO2含量约为5％的细胞培养箱内进行培养。当细胞生长至占培养瓶底面积90%以上时用胰蛋白酶消化并用于实验。

1.4构建慢病毒载体感染U251细胞及筛选

依照文献提供的CD164shRNA有效靶序列设计并构建3条干扰序列及阴性对照序列，并筛选出一条最有效的干扰序列[8]，根据Lipofectamine2000制造商的指示将最优干扰序列的慢病毒表达载体经Lipofectamine2000感染至HEK-293T细胞中，收集病毒上清液离心并测定病毒滴度后感染U251细胞，将病毒液感染细胞12h后更换含10%胎牛血清的培养基，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白荧光，流式细胞仪检测感染效率。

1.5将CD164shRNA及shRNANC感染至U251细胞

将对数生长期的U251细胞接种于24孔板中，每孔2×105个细胞，将5μl浓度为20μmol/L的CD164shRNA与5μl感染试剂lipofeetamine2000混匀后加入细胞中，CD164shRNA的感染终浓度为100nmol/L，将培养板置于细胞培养箱中孵育48h后进行相关功能性和westernblot等检测。shRNANC的感染方法同CD164shRNA的感染。

1.6细胞体外侵袭实验

收集对数生长期U251细胞，加入无血清培养基中，调整细胞浓度为1×104/ml，将300μl细胞悬液和300μl含20％胎牛血清的培养基分别加入Transwell上室和下室，放置细胞培养箱中培养24h后加入结晶紫染色液染色20min，在倒置显微镜下观察穿过小室的蓝染细胞，在高倍镜下随机计数10个视野，计算平均值，每组重复３次。

1.7Westernblot检测细胞中蛋白的表达

U251细胞在冰冷的PBS液中洗涤三次后重悬于细胞裂解液（100μl/孔）中。当细胞裂片至于冰上反应30min，再在4°C温度下12000×g离心20分钟，收集上清后使用BCA蛋白检测试剂盒对蛋白质浓度进行定量分析。蛋白质样品（30μg）使用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳进行后转移到0.45μm的硝酸纤维素膜上，并使用5%脱脂奶粉于４℃下孵育过夜，该膜在4°C与一抗在室温下反应30分钟后，在室温下与二抗再次孵育1h。以内参β-actin蛋白条带灰度值的比值来校正母的蛋白的光密度值。

1.8数据的统计处理

计量数据均以均数±标准差来表现，采用SPSS17.0统计软件包进行统计学分析，使用t检验和方差分析对所得样本数据进行统计学分析，统计学意义校正值设定为P<0.05。

2结果

2.1CD164在胶质瘤组织中的表达

根据2007年WHO胶质瘤分类标准将纳入本组队列的45例病例进行分类，这45例胶质瘤患者临床病理学信息详见表1。qRP-PCR检测结果表明，与正常脑组织正常组织相比较，CD164在胶质瘤组织中的表达显著上调（3.15±0.63vs.0.53±0.12），有统计学显著性（P<0.001）。

2.2CD164对体外胶质瘤细胞侵袭的影响

如图A所示，westernblot实验检测结果表明，CD164在人正常胶质细胞NHA中的表达量较低，而在人胶质瘤细胞株SF295、SHG-44、U87和U251中表达明显升高，差异有统计学意义（F=56.84，P<0.001）；同时与SF295、SHG-44和U87细胞相比较，U251细胞中CD164表达量明显升高（P<0.001），后续试验选择U251细胞作为实验对象。

分别将CD164shRNA或shRNANC感染进入U251细胞72h后，利用westernblot检测U251细胞中的感染情况，结果表明细胞感染CD164shRNA可显著下调CD164在U251细胞中的表达，差异有统计学意义（P<0.001），而感染shRNANC对CD164的相对表达量无明显影响（图B）。如图C所示，细胞侵袭实验表明，U251细胞经感染CD164shRNA后可显著抑制细胞侵袭行为，对照组、shRNANC组和CD164shRNANC组侵袭出ECMatrix胶的细胞数分别为63.4±9.8、66.8±12.1和（7.9±2.3）个，shRNANC组与CD164shRNA组相比较，差异有统计学显著性（P<0.001）。

Westernblot检测CD164在NHA、SF295、SHG-44、U87和U251细胞系中的表达（A）；感染CD164shRNA或shRNANC至U251细胞后对CD164、表达的影响（B）；倒置显微镜下观察分别感染CD164shRNA或shRNANC后对U251细胞侵袭行为的影响（×200）。

3讨论

近期研究发现CD164在多种实体瘤组织中表达明显上调，同时CD164的表达与肿瘤分化程度明显相关[4-6]，但其作用机制尚不明确。本研究中，我们检测了45例胶质瘤组织和癌旁组织中CD164的表达情况，结果显示，CD164在胶质瘤组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织，提示CD164在胶质瘤发生的早期阶段可能充当着抑癌基因的作用，同时CD164在体外胶质瘤细胞株中的表达也高于正常胶质细胞中的表达，这种CD164在良恶性组织及细胞中的表达差异表明CD164与胶质瘤细胞的发生和转移可能存在一定的关联。

在特定生理和病理情况下，上皮细胞暂时丧失极性并表现出具有移行能力的间质细胞的现象称为EMT，既往研究表明，EMT与肿瘤的局部侵袭和远处转移关系密切，已成为当前肿瘤研究的热点之一[1-2]。但目前尚未有CD164与胶质瘤细胞EMT的相关报道。为进一步研究CD164在胶质瘤恶性生物学行为中的作用，本研究通过RNA干扰技术沉默CD164在体外胶质瘤细胞中的表达，发现下调CD164对体外胶质瘤细胞侵袭性行为有明显抑制作用，从而表明CD164与胶质瘤转移密切相关。

综上所述，本研究表明CD164与胶质瘤转移明显相关，但CD164是否对体内胶质瘤同样具有抑制转移作用尚未可知，同时虽然证实CD164可抑制体外胶质瘤细胞EMT，但CD164与EMT之间是直接调控还是间接调控仍需进一步实验明确。但本次研究为临床胶质瘤基因治疗提供一个新的作用靶点，在揭示胶质瘤的发病机制及治疗上具有一定积极意义。

参考文献

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基金项目：湖南省卫生厅科研基金资助项目（C2014-51）