利用液相色谱法测定中药的柚皮苷含量

利用液相色谱法测定中药的柚皮苷含量

薛白云

薛白云（江西省鹰潭市人民医院335000）

【中图分类号】R446.1【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2011）28-0213-03

【摘要】目的建立HPLC法测定常见中药中柚皮苷的方法，测定常见中药中柚皮苷含量。方法WatersSymmetryC18柱（4.6x150mm,3.5μm），流动相为甲醇:乙腈:磷酸缓冲液（0.01mol/LpH3.5）=9:3:8，检测波长为280nm。结果柚皮苷的出峰时间为2min，柚皮苷1.80～350mg/L范围内具有良好的线性关系，R2值为0.9999，平均回收率分别为99.5%-102.5%，相对标准偏差小于5%；香橼、枳实和橘红的柚皮苷含量分别为2.89-5.67%、0.21-0.26%、11.97-2.44%，不同产地的香橼、枳实、橘红中柚皮苷含量的相对标准偏差分别为28.88%、10.63%和26.42%;四磨汤、胃痛丸、橘红丸颗粒和抗骨增生丸中柚皮苷的含量分别为5.99mg/g、2.25mg/g、1.71mg/g、0.30mg/g，不同厂家生产的四磨汤、胃痛丸、橘红丸颗粒和抗骨增生丸中柚皮苷浓度的相对标准偏差分别为8.43%、14.72%、9.90%和3.42%。结论建立了一种简便、准确、适用性广泛地测定中药中柚皮苷的方法，产地对香橼及橘红中柚皮苷含量的影响较大，而不同厂家生产的中成药中柚皮苷的含量偏差相对较小。

【关键词】高效液相色谱法柚皮苷中药原料中成药

DeterminationofnaringininChinesemedicinebyhigh-performanceLiquidChromatographicMethod

(XUEBai-yun,DUANCi-qun)

(People'shospitalofYingtanCity,JiangxiProvince,Yingtan,335000)

【Abstract】Aim:Tosetupaquantitativehigh-performanceliquidchromatographicmethodfordeterminationofnaringinandtoinvestigationnaringincontentincommonChinesemedicine.Method:AnRP-HPCLmethodwassetup,usingSymmetryC18column,methylalcohol:acetonitrile:PBS(containing0.01mol/LpostassiumdihydroganphospatepH=3.5)=18:3:14asmobilephasewithaflowrateof1.0ml/minatthedetectionwavelengthof210nm.Result:retaintimewasabout2min,naringinwellseparatedwithothercompositions.TheCalibrationcurvewasofgoodlinearityintherangeof1.80～350mg/LwithR20.999,recoverieswererangefrom99.5%-102.5%,relativestandardderivationwaslessthan5%.NaringincontentinCitron,Citrusaurantium,andorange-redwere2.89-5.67%,0.21-0.26%,and11.97-2.44%,respectively.Relativestandardderivationofnaringincontentsfromdifferentoriginwere28.88forcitron,10.63forcitrusaurantium,26.42fororange-red.Naringincontentin4soup,stomachpainpill,orangepillboneparticlesandanti-proliferativePillwere5.99mg/g,2.25mg/g,1.71mg/g,and0.30mg/grepectively.Relativestandardderivationofnaringincontentsfromdifferentfactorywere8.43for4soup,14.72forstomachpainpill,9.90fororangepillboneand3.42foranti-proliferativepill.Conclusion:Thismethodisaccurate,sensitiveandconvenientfordetectingnaringincontentofChinesemedicine,Origingreatlyeffectsnaringincontentofthecitronandorange-red,whereas,naringincontentofChinesepatentmedicinearelittleaffectedbyorigin.

【Keywords】High-performanceLiquidChromatographicMethod,naringin,Chinesemedicine,rawmaterial,Chinesepatentmedicine

柚皮苷是一种二氢黄酮类化合物，它又称柚苷、柑桔苷、异橙皮苷、柚皮素-7-O-新橙皮糖苷，学名为柚皮素-7-β-D-葡萄糖（2→1）-α-L-鼠李糖，分子式C27H32O14，分子量580.55[1]。相关研究表明，研究表明，柚皮苷在降血脂[2]、抗氧化[3]、抗菌消炎[4]、抗肿瘤[5]、抗过敏[6]、抗关节炎镇痛[7]、抗心血管疾病[8]及其他多方面[9]具有较强的生物活性，是骨碎补、枳实、枳壳、化橘红等中药[10]的主要有效成分之一。

柚皮苷的含量是衡量这类中药的重要指标之一，目前定量测定柚皮苷的方法有分光光度计法[11]，高效液相色谱法[12]，分光光度计法不能排除结构类似物的干扰，很难精确定量；密度较差，干扰因素过多；虽然液相色谱已经广泛用于测定中药中的柚皮苷，但这些方法大多数都是针对某一种中药中的柚皮苷含量的测定，方法的适用性受到限制。因此，开发一种具有较广泛用途的中药柚皮苷测定方法，对于利用液相色谱法分析定量柚皮苷含量，以此评价中药质量的具有重要的意义。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

Waters高效液相色谱仪（包括Waters1525BinaryhPLC泵，Waters2487紫外检测器，WatersSystemBreeze数据处理工作站）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；eppendorf离心机。

香橼、枳实、橘红购于樟树药材市场；四磨汤、胃痛丸、橘红丸颗粒和抗骨增生丸分别购自不同的医药批发公司。

柚皮苷标准品（sigma公司）；甲醇、乙腈、四氢呋喃（色谱纯,美国TEDIA公司）。

1.2样品处理

1.2.1标准品溶液的制备

精确称取柚皮苷标准品0.0048g，溶于甲醇并定容至10ml，分别用甲醇稀释制成一定浓度的标准溶液。

1.2.2样品溶液的制备

称取一定量的实验样品，粉碎过100目筛，烘干至恒重，称取1g先用乙醚进行索氏抽提去除脂肪类物质，再用50mL丙酮浸提，共浸提3次，合并3次浸提液，旋转蒸发浓缩至干，加入50mL的甲醇溶解并定容至200mL，再经0.45μm针头式微孔过滤器过滤后备用。

1.3色谱条件

色谱柱为SymmetryC18柱，流动相是甲醇:乙腈:磷酸缓冲液（0.01mol/LpH3.5）=9:3:8（V/V），流速1.0ml/min，检测波长280nm，柱温35℃。

2结果与分析

2.1方法的定性分析

图1是柚皮苷标准品及7种分析样品的色谱图。由图1可知，柚皮苷的出峰时间为2min左右，所试验的7种中药的杂质峰与柚皮苷的峰得到了较好的分离，说明方法的适用性较好。

图1样品的HPLC色谱图

Fig1.HPLCchromatogramofsamples

注：图中A、B、C、D、E、F、G、H分别是柚皮苷标准品，枳实、橘红、香橼、四磨汤、橘红丸颗粒、胃痛丸、抗骨增生丸的液相色谱图。

2.2标准工作曲线及检测限

精密吸取柚皮苷的标准样品的梯度稀释样，在选定的色谱条件下进样20μl进行分析，以柚皮苷的浓度（mg/L）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算其回归方程。结果表明，在1.8-350mg/L的浓度范围内，柚皮苷分析测定的标准工作曲线的回归计算方程为y=42381x，回归方程的R2值为0.9999，说明在此浓度范围内线性关系良好。基线噪音峰面积响应值为6110，以3倍噪声计算检测限，则柚皮苷的检测限为0.43mg/L；以10倍噪声计算方法的定量检测限，则最低定量检测浓度为1.44mg/L。

2.3准确度

采用回收率进行方法准确度的评价，分别称取不同柚皮苷标准品，用丙酮提取，浓缩后用甲醇溶解定容，用液相色谱测定其浓度，以计算其回收率,结果如表1所示。由表1可知，在1.44-328.75mg/L浓度范围内，柚皮苷的回收率处于99.53%-102.14%之间。

表1回收率试验结果

Table1Resultofrecoverytest

2.4精密度

分别以4种中成药为本底，加入一定的柚皮苷，用液相色谱检测，每个样品溶液5个平行样，计算相对标准偏差，结果如表2所示。相对标准偏差都小于5%，说明样品的精密性良好。

表2样品精密度实验结果

Table2Resultofprecisionexperiment

注：样品1是以抗骨增生丸为本底；样品2是以四磨汤为本底；样品3是以橘红丸颗粒为本底，样品4是以胃痛丸为本底。

2.5几种原料中药柚皮苷含量的测定

对市售的几种原料中的柚皮苷含量进行测定，结果如表3所示。由表3可知，不同原料药中的柚皮苷浓度差别较大，香楷中柚皮苷含量为2.89-5.67%，不同产地香橼的柚皮苷含量差别较大，其相对标准为28.88%；枳实中柚皮苷的含量为0.21-0.26%，不同产枳实中柚皮苷含量的相对标准偏差为10.63%；橘红中柚皮苷的含量为1.97-3.31%，不同产地橘红中柚皮苷含量的相对标准偏差为26.42；这说明，产地不同的原料药中柚皮苷的浓度具有较大的差异，这种差异在香橼及橘红中非常明显。

表3几种原料药中柚皮苷含量测定结果

Table3analysisresultsofnaringincontentoflawChinesemedicine

2.6几种中成药柚皮苷含量的测定

对市售的几种原料中的柚皮苷含量进行测定，结果如表4所示。由表4可知，四磨汤中柚皮苷的含量为5.99mg/g，胃痛丸中柚皮苷含量为2.25mg/g，橘红丸颗粒中柚皮苷含量为1.71mg/g，抗骨增生丸中柚皮苷的含量为0.30左右。不同厂家生产的四磨汤、胃痛丸、橘红丸颗粒和抗骨增生丸中柚皮苷浓度的相对标准偏差分别为8.43%、14.72%、9.90%和3.42%，与中药原料中柚皮苷的含量差异较大相比，不同厂家生产的中成药中柚皮苷含量相对稳定。

表4几种中成药中柚皮苷含量测定结果

Table4analysisresultsofnaringincontentofChinesemedicine

3结论

3.1建立了利用液相色谱法测定中药中柚皮苷的方法，用SymmetryC18柱，在甲醇：乙腈：磷酸缓冲液（0.01mol/LpH3.5）=9:3:8（V/V）、流速1.0ml/min、柱温35℃的条件下进行分离，在280nm波长条件下检测，柚皮苷的出峰时间为2min，柚皮苷与杂质得到了很好的分离。方法的标准曲线回归方程为：y=42381x；方法的检测限为0.43mg/L，定量检测浓度为1.44mg/L；柚皮苷的回收率在99.5%-102.5%之间，相对标准偏差小于5%。

3.2几种含柚皮苷的中药原料中，香橼中的柚皮苷含量最高，枳实中含量相对较低；不同产地的中药原料中柚皮苷的含量并不相同。

3.3几种中成药中柚皮苷的含量差别较大，其中四磨汤中柚皮苷含量相对较高，不同厂家生产的中成药中柚皮苷的含量相对较稳定。

参考文献

[1]贾冬英.柚皮苷提取纯化及其络合改性研究[D].四川大学硕士论文,2002.

[2]BokSH,LeeSH,ParkYB,etal.Plasmaandhepaticcholesterolandhepaticactivitiesof3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoAreductaseandethylCoA:cholesteroltransferasearelowerinratsfedcitrusPeelextractoramixtureofcitrusbioflavonoid[J].JNutr.,1999,129(6):1182-1185.

[3]LimassetB，DoucenCL,DoreJC,etal.Effectsofflavonoidsonthereleaseofreactiveoxygenspeciesbystimulatedhumanneutrophils:Multivariateanalysisofstructure-activityrelationships[J].BiochemicalPharmacology,1993，46(7):1257-1271.

[4]JeonSM,BokSH,JangMK,etal.Comparisonofantioxidanteffectsofnaringinandprobucolincholesterol-fedrabbits[J].ClinicaChimicaActa,2002,317(1-2):181-190.

[5]KawaguchiK,KikuchiS,hasegawah,etal.Suppressionoflipopolysaccharide-inducedtumornecrosisfactor-relaeseandliverinjuryinmicebynaringin[J].Eur.J.Pharmacol.,1999,368(2-3):245-250.

[6]冯宝民,蒋革,贾景明,等.柚皮苷和新橙皮苷抗过敏作用的研究[J].大连大学学报,2005,26(4):63-64.

[7]赵湘洪,陈宝兴.骨碎补对实验性骨性关节炎的治疗作用[J].中药通报,1987,12(10):41-45.

[8]王维信,王敖格.骨碎补双氢黄酮甙对心血管系统的药理作用[J].药学通报,1984,(2):55.

[9]杨宏亮,田珩,李沛波,等.柚皮苷及柚皮素的生物活性研究.中药材,30(6):752-754.

[10]肖崇厚,杨松松,洪筱坤,等.中药化学[M].上海:上海科学技术出版社,1997,265

[11]梁宝英.紫外分光光度法测定柚织实中柚皮苷含量[J].中华综合临床医学杂志,2004,3(3):63-64.

[12]郝明虹,王栋,胡寿荣.hPLC法测定气滞胃炎颗粒中柚皮苷的含量[J].中国药品标准,2003,4(3):43-45.