亚叶酸钙细菌内毒素检查方法的建立

亚叶酸钙细菌内毒素检查方法的建立

郭海波王晓丽

郭海波王晓丽（辽宁省朝阳市第二医院辽宁朝阳122000）

【中图分类号】R446.1【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）4-0127-02

【摘要】目的建立亚叶酸钙细菌内毒素检查方法。方法参照《中国药典》2005年版二部收载的细菌内毒素凝胶法对亚叶酸钙进行实验。结果通过干扰试验证明将亚叶酸钙稀释成0.5mg·ml-1后对试验无干扰作用,用灵敏度为0.25EU·ml-1的鲎试剂检查细菌内毒素方法可行，有效。结论浓度低于0.5mg·ml-1的亚叶酸钙其菌内毒素检查法可以代替家兔法来控制亚叶酸钙注射液的质量

【关键词】亚叶酸钙干扰试验细菌内毒素热源检查

前言

亚叶酸钙是一种抗癌药，临床上主要用于治疗晚期结肠、直肠癌[1]。细菌内毒素检查法有快速、准确、灵敏、经济实用等优点，但2005版中国药典正文规定的热原检查项中，执行家兔检查法。所以本文对亚叶酸钙的热原检查采用细菌内毒素法进行试验，评价亚叶酸钙采用细菌内毒素法的可行性。

1﹑实验材料和仪器

1.1实验材料

细菌内毒素检查用水：批号：090507，规格：5ml/支湛姜博康海洋生物有限公司。

鲎试剂：批号：0802020，灵敏度：0.25EU/ml；批号：0801080，灵敏度：0.125EU/ml批号：0802030，灵敏度：0.05EU/ml；批号：0708280，灵敏度：0.06EU/ml；批号：0903252灵敏度：0.03EU/ml湛江博康海洋生物有限公司；批号：0806020，灵敏度：0.25EU/ml湛江安度斯生物有限公司。

受试品（S）：亚叶酸钙注射液：批号：20090902、20090702、20090502，规格：100ml亚叶酸钙0.1：氯化钠0.9，大连天宇制药有限公司。

细菌内毒素国家标准品：批号：981，效价：9000EU/支湛江安度斯生物有限公司。

1.2实验仪器

HWS26型电热恒温水浴锅：上海恒科技有限公司。

数显漩涡混合器：德国IKA公司。

DHG-9075A型电热恒温鼓风干燥箱：上海－恒科技有限公司。

2试验方法与结果

2.1实验方法

2.1.1样品内毒素限值的（L）的确定

按照2005年版中国药典，药品、生物制品的细菌内毒素限值按下面公式确定：

L＝K/M

根据热原检查法[1]亚叶酸钙注射液，剂量为10ml/kg，可得L＝0.5EU/ml。

2.1.2受试品最小有效稀释浓度CMVD的范围

2005年版中国药典规定最小有效稀释浓度由下面公式确定：

C＝λ/L

市售的鲎试剂灵敏度一般在0.03～0.5EU/ml，对于灵敏度为0.03、0.06、0.125、0.25、0.5EU/ml的鲎试剂，CMVD浓度分别为0.06、0.12、0.25、0.5、1.0mg/ml；

2.2鲎试剂灵敏度复核[2]

鲎试剂灵敏度的复核试验应按照中国药典2005年版方法规定的条件下进行,鲎试剂的灵敏度用λ表示。

将细菌内毒素国家标准品用细菌内毒素检查用水（BET）溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的细菌内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒。取分装有0.1ml鲎试剂溶液的试管18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水（BET）作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃恒温器中，保温60分钟。结果见表1

表1两种鲎试剂复核试验结果

内毒素浓度EU/ml0.50.250.120.06NC反应终点浓度

重1++———0.25

复2++———0.25

管3++———0.25

数4++———0.25

注：NC为阴性对照管

λ=lg-1（∑Xx/4）

=lg-1（lg0.25+lg0.25+lg0.25+lg0.25）

=0.25EU/ml

结果表明：鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml在0.5λ～2.0λ的范围内，符合规定。

2.3干扰预试验

方法：将受试品用细菌内毒素检查注射用水BET稀释成4mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml的供试品溶液分别使用λ＝0.5EU/ml、λ＝0.25EU/ml、λ＝0.125EU/ml的鲎试剂进行预干扰试验，结果见表2。

表2不同浓度受试品干扰预试验结果

TAL

EU/ml浓度mg/ml

4210.50.25NCPC

λ＝0.5NPC------------++

PPC1--++++++++

PPC2----------

λ＝0.25NPC----------

PPC1----++++++

PPC2----------

λ＝0.125NPC----------

PPC1------++++

PPC2----------

注：NPC为样品溶液；PPC1为样品溶液中含有2λ内毒素；PPC2为样品溶液中含有1/4λ内毒素;NC为阴性对照管；PC为阳性对照管。

结果表明：亚叶酸钙注射液浓度在0.5mg/ml以下时，对鲎试剂的凝集反应无增强或抑制作用。

2.4干扰试验[3－4]

根据干扰试验的结果可知受试品溶液的最大不干扰浓度为0.5mg/ml，在最小有效稀释浓度范围内，使用两个厂家的鲎试剂（λ=0.25EU/ml）进行反应，每一浓度做4管同时用上述稀释液和内毒素检查用水（BET）各做2支阴性对照管，按Es=Log－1(∑Xs/4)和Et=Log－1(∑Xt/4)计算BET水制成的细菌内毒素溶液的反应终点浓度几何平均值(Es)和受试品稀释液制成的细菌内毒素溶液的反应终点浓度几何平均值(Et)，结果见表3。

表3两个厂家鲎试剂对受试品的干扰试验结果

“++++”表示4管均阳性,“----”表示4管均阴性,“--”表示2管均阴性,NC为阴性对照管

结果表明：ES值均在0.5λ～2.0λ之间，且Et值均在0.5ES～2.0ES之间，说明受试品在0.5mg/ml浓度以下时对细菌内毒素检查无干扰作用[5]。

2.5家兔法热原检查[6]

按中国药典2005年版操作，结果见表4

表4三批受试品热原检查结果

样品批号热原试验

20090902合格

20090702合格

20090502合格

结果表明：3批样品热原检查结果符合规定

3讨论

3.1由表1的实验结果可知鲎试剂的灵敏度在0.5λ～2.0λ的范围内符合药典规定，这两批鲎试剂可以用于内毒素检查。

3.2本试验证实亚叶酸钙的细菌内毒素限值为0.5EU/ml。由2的实验结果可知；①亚叶酸钙不经稀释对鲎试剂与内毒素的反应有干扰作用，但经内毒素检查用水稀释成0.5mg/ml或更低浓度后干扰消除。②受试品在最小有效稀释浓度范围含有2λ内毒素时，鲎试剂均能与受试品产生阳性反应。

3.3由表3的实验结果可知；①用内毒素检查用水制成的细菌内毒素溶液和用受试品稀释液制成的细菌内毒素溶液在2λ全部显阳性，0.25λ全部显阴性，证实该实验有效；②亚叶酸钙注射液不经稀释对鲎试剂的凝胶化反应有抑制作用但经稀释成0.5mg/ml或更低浓度,选择灵敏度0.25EU/mL或更高灵敏度的鲎试剂,对亚叶酸钙细菌内毒素检查无抑制和增强作用。因此稀释成0.5mg/ml或更低浓度的亚叶酸钙,选择灵敏度0.25EU/mL或更高灵敏度的鲎试剂,可以来进行细菌内毒素检查。

3.4由表4实验结果可知家兔检查法结果与稀释成0.5mg/ml或更低浓度的亚叶酸钙,选择灵敏度0.25EU/mL或更高灵敏度的鲎试剂进行细菌内毒素检查的结果一致,可用细菌内毒素检查法来控制亚叶酸钙的质量，稀释成0.5mg/ml或更低浓度后的亚叶酸钙细菌内毒素检查法代替家兔法是可行的。

3.5建立亚叶酸钙的细菌内毒素检查方法时,首先通过干扰实验筛选出无干扰浓度范围，进而通过干扰实验来验证无干扰浓度从而确定鲎试剂的灵敏度。亚叶酸钙注射液要由家兔法转换成内毒素检查法，首先应根据最大剂量计算确定亚叶酸钙注射液的内毒素限值，然后选3批产品，按照检查法要求做干扰实验，在验证无干扰的条件下进行细菌内毒素检查。

参考文献

[1]国家药典委员会编.中国药典2005年版附录.

[2]国家药典委员会编.中国药典（2000年二部）[S].北京；化学工业出版社，2000.二部；附录86－87.

[3]肖贵南，吴招娣，关永源.顺铂注射液细菌内毒素的动态浊度法定量研究[J].中国药理学通报，2003，19（4）：435－437.

[4]孙长海，苑庆华.低分子量肝素钙注射的细菌内毒素检查[J].中国生化药物杂志，2003，23（4）：195～197.

[5]冀建明，叶良君．克林霉素磷酸酯氯化钠注射液细菌内毒素检查法的可行性研究[J]．中国药师，2006，9(4)：330－331.

[6]ISBN7-5025-2736-2/R.60(S).

[7]陈潮,张雷,张振家.曲克芦丁注射液细菌内毒素检查法的研究[J].医药导报,2004,23(12):957-958.

[8]CR.Endosafe公司资料.