胸腺法新合成工艺的研究

胸腺法新合成工艺的研究

葛存慧

哈药集团生物工程有限公司黑龙江省哈尔滨市150025

胸腺法新（Tα1）是一种免疫调节因子，它可以启动T淋巴细胞的成熟、刺激分泌干扰素及各种淋巴介素，以及增强自然杀伤（NK）细胞介导的细胞毒性，由28个氨基酸组成的多肽，分子式：C129H215N33O55化学结构N-Acetyl-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH。最早由美国Sciclone公司合成上市,药品名“日达仙”(Zadaxin)。我国也已有数家生产其原料和制剂，原料和制剂均已有国家药品标准，为胸腺法新在我国的应用打好了基础。

中图分类号：R392文献标识码：B

1、粗肽的合成

1.1树脂的溶胀

取Fmoc-Asn(trt)-CTCresin(替代度0.60mmol/g)，40mmol，加入至反应柱中,加入500mlDMF，再开氮气自下而上柔和冲混液体和树脂，搅拌溶胀30分钟后停止，抽滤除去液体。

1.2脱除保护基

加入500ml20%的六氢吡啶/DMF溶液(脱帽液),开氮气，搅拌反应5分钟，抽去液体，用500mlDMF洗涤,洗涤2次。再加入500ml20%的六氢吡啶/DMF溶液,搅拌反应10分钟后抽除,用500mlDMF洗涤,洗涤5次。

1.3接肽

按树脂取代摩尔数的4倍量投料，称取Fmoc-Glu(otBu)-OH68g,HATU60.8g,溶入500mlDMF中,冰浴下加入冷却的N-甲基吗啡啉26.5ml,激活10分钟后加入到反应柱中,15℃～25℃下反应2小时后（用茚三酮显色法检测不显色）抽除。加入400mlDMF洗涤,洗涤3次。

1.4偶联循环:

重复1.2至1.3步骤的操作,按照胸腺法新氨基酸序列,换不同的氨基酸逐步进行偶联直至最后Fmoc-Ser(tBu)-OH偶联完毕。偶联完毕之后，再按1.2步操作进行去掉保护。

各种活化氨基酸均按树脂取代摩尔数的4倍量投料，投料见表1。

表1、活化氨基酸投料表

1.5N端修饰：

按树脂取代摩尔数的20倍量投料配制乙酸酐76ml，吡啶65ml,DMF1000ml,混合均匀后加入柱中，反应24小时后抽除，用1000mlDMF洗涤5次,1500mlDCM洗涤3次,1000mlMeOH洗涤3次,每次5分钟。转出树脂,减压干燥。制得胸腺法新肽树脂242.2g。

1.6裂解

置肽树脂于圆底瓶中，冰浴下冷却，加入已经预冻至-10℃下的裂解液（二巯基乙醇:水:三氟乙酸=5:5:90（v/v））2400ml，撤除冰浴,室温下搅拌反应2.5小时。过滤除去树脂,滤液加入到10倍体积冰乙醚中。沉降5小时。离心洗涤5次,每次约10000ml乙醚。转出沉淀,减压干燥，制得胸腺法新（Tα1）的粗制品制得含量50.0%的粗肽61.2g，产率为24.6%。

2纯化、精制

将粗肽按1：10（g/ml）与纯水混合溶解，用0.45μm微孔滤膜过滤制得粗肽待纯化液。

2.2纯化：

2.2.1一次纯化制备

以0.1%TFA溶液为流动相A，乙腈为流动相B；制备液相色谱系统，采用10μm的反相C18(41.4×250mm)填料，紫外检测器设定220nm，调流速60ml/min，以5%的乙腈，平衡15分钟。取粗肽液（约含目的肽5g）进样，

采用：5%2min5%；17%40min23%；50%8min50%梯度洗脱。注意吸收值变化，去除杂峰，分别收集峰前、峰顶、峰后三段，峰顶纯度大于90%。峰前及峰后纯度大于60%的收集液浓缩至适量后，同法纯化收集得纯度大于90%纯化液

合并各次峰顶段收集液，旋转浓缩至适量（约为原体积的三分之一）。制得含量18.8mg/ml胸腺法新纯化液共980ml精制收率＝60.1%。

2.2.2二次纯化制备

以0.2%磷酸溶液(用氨水调pH至6.5)为流动相A，乙腈为流动相B；制备液相色谱系统，采用5μm的反相C18填料，紫外检测器设定220nm，调流速60ml/min，以5%的乙腈，平衡15分钟。

取一次纯化液，约含目的肽5g，进样，采用5%2min5%；9%30min15%；40%8min40%梯度洗脱。注意吸收值变化，去除杂峰，分别收集峰前、峰顶、峰后三段，峰顶纯度大于96%。峰前及峰后纯度大于80%的收集液浓缩至适量后，同法纯化，得纯度大于96%纯化液。

合并各次峰顶段收集液，旋转浓缩至适量（约为原体积的三分之一）制得含量25.2mg/ml胸腺法新纯化液共630ml。精制收率86.4%。

2.2.3脱盐

以注射用水为流动相A，乙腈为流动相B；准备制备液相色谱系统，采用10μm的反相C18(41.4×250mm)填料柱，紫外检测器设定220nm，调流速40ml/min，先以80%的乙腈，冲柱10分钟，然后以2%的乙腈，平衡15分钟，梯度洗脱。

取胸腺法新纯化液（约含目的肽5g）进样，采用2%15min2%；5%50min40%梯度洗脱，主峰出现时开始收集，至无杂峰出现时结束。

取胸腺法新纯化液（约含目的肽5g）上样，合并各次收集液，35℃以下旋转真空浓缩至适量（约为原体积的三分之一），制得含量25.4mg/ml胸腺法新精制液610ml，计算精制收率＝97.5%。制得胸腺法新精制液，可冷冻暂存。

3冻干

取冷冻的胸腺法新精制液，先室温水浴化开，0.22μm精密过滤,分装不锈钢盘冻干，冻干曲线如下：

(1)室温0.5h降到-40℃；保温3h；

(2)开真空泵抽真空；

(3)-40℃在0.5h升温到-15℃；并保温5小时，0.5h升温到0℃；保温10h；0.5h升温到10℃；保温10h；0.5h升温到35℃保温30h；

(4)破真空出箱；结束冻干。

制得胸腺法新15.1g，产品总收率12.2%。

[参考文献]

1.韩香等，人胸腺肽α1的固相合成及体外活性研究，中国药物化学杂志2004Vol.14,No.1。

2.RandyW.Jackson,JohnC.TaboneJ.JeffryHowbert.IdentificationofTNF-αInhibitorsfromaSplit-PoolLibraryBasedonaTyrosine-ProlinePeptidomimeticScaffold.Bioorganic&MedicinalChemistryLetters13(2003)205–208:

3.黄臻辉等，合成胸腺肽α1的分离与纯化药物生物技术2001,8（4）。

4.程虎等，固相合成胸腺素α1南京工业大学学报2004Vol.26No.2。