大肠埃希菌耐药性分析与产ESBLs基因型研究

大肠埃希菌耐药性分析与产ESBLs基因型研究

王淑凤1，2邢金磊2周齐2

1（青岛大学,山东青岛）

2（海阳市人民医院，山东海阳）

[摘要]：目的：监测海阳市产ESBLs与非产ESBLs大肠埃希菌的耐药情况及产β-内酰胺酶基因型分布。方法:收集2014年海阳市人民医院临床标本中96株大肠埃希菌，对产ESBLs菌株和非产ESBLs菌株分别用whonet5.6进行耐药统计与分析，并用聚合酶链反应对产酶菌株耐药基因进行检测。结果:产ESBLs菌株耐药率明显高于非产ESBLs菌株。43株产酶菌株检测出的耐药基因型为CTX-M和TEM，其阳性率分别为55.81%和6.98%，未检测出SHV和OXA。结论:海阳市人民医院产ESBLs大肠埃希菌耐药性明显高于非产ESBLs大肠埃希菌，产ESBLs菌株携带的耐药基因以CTX-M为主。

[关键词]：ESBLs大肠埃希菌耐药基因

AnalysisofE.coliresistanceandresearchonproducingESBLsgenotypes

WangShufengXingJinleiZhouQi

(Qingdaouniversity,Qingdao)

[Abstract]:Objective:TomonitoretheresistanceofproducingESBLsandnon-producingESBLsofEscherichiacoliinHaiyangcity,andtoanalysisthegenotypedistributionofproducingESBLs.Methods:Tocollect2014clinicalspecimensinhaiyangcitypeople'shospitalof96strainsofe.coli,theproducingESBLsstrainsandnonproducingESBLsstrainsrespectivelyusingwhonet5.6resistant,statisticsandanalysisbyusingpolymerasechainreactiontotesttheenzymeproductionstrainsofresistantgenes.Results:ProducingESBLsstrainsresistantratewassignificantlyhigherthanproducingESBLsstrains.43strainsenzymeproducingstrainsweredetectedresistantgenotypesofCTX-MandTEM,thepositiveratewere55.81%and55.81%,notbeendetectedtheSHVandOXA.Conclutions:Haiyangcitypeople'shospitalofproducingESBLse.coliresistancesignificantlyhigherthannon-producingESBLse.coli,producingESBLsstrainscarryingresistancegenesisgivenprioritytowithCTX-M.

[Keywords]ESBLs;Escherichiacoli;resistancegenes

引言

大肠埃希菌是革兰氏阴性杆菌中造成医院感染的主要致病菌之一，可以造成病人各种部位的感染。近年来，随着抗菌药物广泛使用，以及一些临床医生对抗菌素的滥用，产ESBLs菌株的逐年增加，这已近引起了国家各级卫生机构的高度重视。本研究针对海阳市人民医院96株大肠埃希菌产ESBLs菌株与非产ESBLs菌株进行耐药比较及相关耐药基因型测定。现报告结果如下。

材料与方法

1.材料

1.1菌株来源与质控菌株菌株来源于2014年海阳市人民医院临床分离的96株大肠埃希菌。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。

1.2主要仪器与试剂VITEK2COMPACT微生物自动分析仪，PCR紫外凝胶成像系统,各种电泳缓冲液PCR引物和TaqDNA聚合酶等。

2.方法

2.1菌株鉴定及药敏测定所有菌株通过VITEKCOMPCT微生物全自动分析仪进行鉴定和药敏试验。将仪器筛选出的产ESBLs的菌株采用双纸片协同试验进行确认。计数资料采用卡方检验进行统计分析,p<0.05具有统计学意义。

2.2PCR模板制备将-41℃保存的产ESBLs大肠埃希菌菌株分别接种于血琼脂平板上，在二氧化碳培养箱中过夜培养16-18小时。培养出的单个菌落直接作为模板使用。

2.3引物设计

TEMF:5’-ACGACATTCGTCAACTGCAA-3'414bp

R:5’-TAAATTGGCACCCTGTAGGC-3'

SHVF:5’-TCTCCCTGTTAGCCACCCTG-3'592bp

R:5’-CCACTGCAGCAGCTGCCGTT-3'

CTX-MF:5’-TGCGGTATTATCCCGTGTTG-3'343bp

R:5’-TCGTCGTTTGGTATGGCTTC-3'

OXAF:5’-GTCTTTCAAGTACGGCATTA-3'822bp

R:5’-GATTTTCTTAGCGGCAACTTA-3'

2.4PCR扩增

PCR反应体系共30μl，包括0.2μlPremixTaq酶，3.0μl引物，牙签挑一点菌落作为DNA模板，21.4μl无菌双蒸水,3μl10×Buffer。PCR扩增条件：94℃预变性7min，变性94℃30s，复性55℃30s，延伸72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。然后将扩增产物点样于1.2ml/dl琼脂糖凝胶上进行电泳30min，在凝胶成像系统上成像观察结果。

结果

1.菌株分布

经调查表明，来自于临床标本的96株大肠埃希菌中有43株为产ESBLs菌株，主要来源于普外二科，构成比为25.58%。标本主要来源于脓液和血液，分别为18株和13株，构成比分别为41.86%、30.23%。

2.产ESBLs和非产ESBLs大肠埃希菌耐药情况比较

研究结果表明，来源于该医院的96株大肠埃希菌中，产ESBLs菌株耐药性明显高于非产ESBLs菌株。二者对9种药物耐药性具有显著的统计学意义（P<0.05）。九种药物分别为阿米卡星、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢替坦、头孢西丁、厄他培南、庆大霉素、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦和复方新诺明。产ESBLs菌株对氨苄西林和头孢唑啉耐药性为100%；氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、环丙沙星、左氧氟沙星和复方新诺明耐药率皆大于60%。对阿米卡星、厄他培南、亚胺培南和哌拉西林/他唑巴坦尚有良好的敏感性。非产ESBLs菌株对氨苄西林耐药性为77.4%；复方新诺明耐药性54.7%；对阿米卡星、头孢西丁、亚胺培南和帕拉西林/他唑巴坦敏感率为100%。

3.产ESBLs大肠埃希菌基因型检测结果

在43株产ESBLs大肠埃希菌中有24株携带CTX-M基因，3株携带TEM基因，其中有2株同时携带如上两种基因。未检测出SHV和OXA两种基因。产ESBLs大肠埃希菌CTX-M与TEM两种耐药基因PCR扩增片段凝胶分析分别见图1和图2，扩增片段大小与设计一致。

讨论

大肠埃希菌是最为常见的产ESBLs革兰氏阴性杆菌之一。超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）产生及播散给临床抗感染治疗带来极大挑战，是新一代β-内酰胺类抗生素耐药的主要原因。它不仅可水解普通β-内酰胺抗菌素的β-内酰胺环,而且对耐酶的广谱β-内酰胺抗菌素尤其是头孢他啶和氨曲南等新型广谱头孢菌素的β-内酰胺环亦有水解作用［1］。本研究中显示产ESBLs大肠埃希菌对氨曲南耐药率为65.1%，对头孢他啶耐药率为34.9%，皆有较高的耐药性。

ESBLs基因型有TEM型、SHV型、CTX-M型和OXA型等，大多数为TEM型和SHV型。CTX-M型酶能水解绝大部分头孢菌素，典型的CTX-M型酶对头孢噻肟具有超强水解能力，而对头孢他啶中低度耐药，还有一种为变异型CTX-M型酶，可以将头孢他啶水解。TEM型酶是由TEM-1和TEM-2的基因发生突变造成1-4个氨基酸改变而形成的一系列酶蛋白。该基因由质粒介导，主要引起细菌对β内酰胺类抗生素耐药［2］。近年来,CTX-M型逐渐成为我国主要流行亚型［3］。本研究显示本院43株产ESBLs大肠埃希菌中有24株携带CTX-M基因，占55.8%，是本院产ESBLs菌株的主要基因型；有3株携带TEM基因，占6.98%。符合近年来我国产ESBLs菌株主要流行型别。

我院分离的96株大肠埃希氏菌中产ESBLs菌株共43株，阳性率为44.79%。比申月静等［4］在文献中报道产ESBL大肠埃希菌阳性率55.6％低，比天津市红桥医院［5］报道的21.7％要高，比范雪莲等［6］报道2013年广东省海珠区妇幼保健院产ESBLs大肠埃希菌检出率为61.3%低，比王兴林［7］等报道贵州黔西南州产ESBL大肠埃希菌检出率为29.33％高。大肠埃希菌也是医院感染常见的病原菌，可引起肠道外感染。本次研究结果显示,大肠埃希菌可引起各种部位器官感染,包括伤口感染、泌尿系感染、血液感染等,最主要是伤口感染和血液感染。产ESBLs菌株主要来自于主要来源于普外二科、ICU、妇科和肾内科。

产ESBLs大肠埃希菌耐药情况越来越严重，院内感染管理科和临床医生应当重视病原学检查,对已经感染产ESBLs菌株的患者进行隔离治疗，加强临床诊疗环境的检测，重视手卫生，避免医患、患者之间相互传染，防止产ESBLs大肠埃希菌在全院的流行甚至暴发流行。重视实验室病原菌药物敏感性试验，临床医生养成根据药敏结果选择和及时更改抗生素的用药习惯，合理使用抗生素，避免滥用。

参考文献

[1]滑立伟,秦树林.产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)细菌的现状及其对策［J］.InfectdisInfo,2000,13(4).

[2]SirotD,SirotJ,LsbiaR,etal.Transferableresistancetothird-generationcephalosperinsinclinicalisolatesofKlebsiellapnermoniae:identificationofCTX-1,anovelβ-lactamase［J］.JAntinicrobChemother,1987,20(3):323-334.

[3]张玲.产ESBLs腹泻病原菌的耐药性和分子流行病学研究［D］.中国人民解放军军事医学科学院,2008.

[4]申月静,兰英华,李用国.产超广谱β－内酰胺酶大肠埃希菌感染分布和耐药性的分析［J］.国际检验医学杂志,2014,35（17）.

[5]姚冬梅.大肠埃希菌的临床分布及耐药性分析［J］.继续医学教育,2014（11）.

[6]范雪莲,林海标,黄惠伦,王淑媛,赖兆新,谭少葵,容永忠,王建兵.442株大肠埃希菌临床感染分布及耐药性分析［J］.国际检验医学杂志.2014（23）

[7]王兴林,文德学,李莹.大肠埃希菌产超广谱β－内酰胺酶的基因型研究及耐药分析［J］.中国卫生检验杂志,2014（24）.