精子优化处理后顶体酶活性与IVF受精率相关性的研究

精子优化处理后顶体酶活性与IVF受精率相关性的研究

耿岚1李蓉1罗永胜2郝桂琴1王勇1钱卫平

耿岚1李蓉1罗永胜2郝桂琴1王勇1钱卫平1（通讯作者）（1北京大学深圳医院生殖医学科广东深圳518036）（2深圳市福田区第二人民医院内科广东深圳518049）

【中图分类号】R698【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）50-0145-02

【摘要】目的探讨精子优化后顶体酶活性变化与体外受精(IVF)受精率的关系。方法采用分光光度比色法，对接受IVF治疗的93例不育夫妇男方精液，测定优选处理前精子顶体酶活性，分析其与IVF受精率的相关性。结果优选前的精子顶体酶活性与IVF受精率无明显相关性，单纯精子顶体酶活性降低并不影响IVF受精率。结论精子顶体酶活性与IVF受精率无明显相关性，通过精子优化处理后，可以预测IVF受精率。

【关键词】优化顶体酶活性IVF受精率

不育症涉及男女双方多种因素和多个环节，其中，男性不育约占不育症的50%[1]，而男性不育多数是由精子功能障碍引起。顶体酶是精子顶体内一种特殊的丝氨酸蛋白溶解酶，在精子穿透卵母细胞透明带时起溶解透明带作用，因而其活性高低可直接影响精子穿透卵母细胞透明带和精卵结合[2,3]。本研究拟对常规IVF治疗中经密度梯度离心优选处理前和处理后的精子顶体酶活性的改变进行研究并与IVF受精率联系，以期发现精子顶体酶活性与IVF受精率的相关性，为临床选择常规IVF还是ICSI治疗提供参考。以探讨精子顶体酶活力测定在男性不育症辅助诊断中的意义。

1资料和方法

1.1一般资料

研究对象选自2008年4-2012年3月间在北京大学深圳医院生殖科就诊，并选择常规IVF治疗的93例不育夫妇，女方年龄26～42岁，平均年龄34岁；男方年龄25～56岁，平均年龄37岁；不育年限2～10年。93例不育夫妇中，男方精液均达到IVF标准且均可采用分光光度比色法在半年内检测至少2次精子顶体酶活性即：精子计数>10×106/ml，精子前向活动率>30%。

1.2检测方法

1.2.1精液的收集及顶体酶活性的检测

男方在取精前禁欲2～7d，精液取出后装入无菌无毒取精杯中，置于25℃恒温室，待其自然液化后充分混匀计数，然后采用分光光度比色法检测精子顶体酶活性。分光光度计读取吸光度值，正常参考值为48.2-218.7υIU／106精子。

1.2.2精子顶体酶活性定量检测

根据改良Kennedy法定量检测精子顶体酶活性（深圳华康生物医学工程有限公司生产的试剂盒），具体为：（1）每份标本同时设测定管和空白管，每管参加反应的精子数为7.5×106个，2000g离心20min；(2)倾倒弃去精浆，加入抑制剂，去除精浆蛋白酶抑制因子；（3）于测定管和对照管各加入反应液，然后在对照管中加入终止液，24℃准确孵育1h，反应液中包含BAPNA底物和pH8.0缓冲液，在pH8.0的缓冲液中测定管内的前顶体素活化为顶体酶，水解BAPNA底物，分解产生有色产物硝酰基苯胺；（4）1h后在测定管中加入终止液，终止反应后，将测定管和对照管2000g离心15min，上清液移入0.5cm比色皿，410nm波长比色，蒸馏水调零，读取各管OD值。根据公式：顶体酶活性=(测定管OD值-对照管OD值)×10／247.5×7.5，计算每106精子的总项体酶活性。

1.2.3梯度离心法优化处理精液

新鲜液化精液采梯度离心法洗涤，具体为：取无菌无毒试管，加入2ml40%Puresperm，然后于其下方缓慢加入2ml80%Puresperm，制备好双层密度梯度；在制备好的密度梯度上加入液化精液，离心20min去上清，将沉淀吸到含1006培养液的离心管中，离心2000rp×10min；再次去上清，将沉淀吸到含10%人血白蛋白的1020培养液的离心管中，离心2000rp×10min；上游调整精子密度，备用。

1.2.4具体试验步骤

93例不育夫妇女方全部采用GnRH/FSH/HCG长方案，于月经周期第3天采用GnRH-a降调节，根据患者年龄、既往治疗史、性激素水平以及B超监测窦卵泡数选择适当剂量的FSH促排卵，并依据阴道B超、血清雌激素测定、连续尿LH监测，当至少有3个卵泡的平均直径＞16mm或两个卵泡平均直径＞18mm时，适时注射HCG5000IU或10000IU，注射HCG后36h经阴道超声显像引导下穿刺卵泡取卵。解剖显微镜下寻找卵-冠-丘复合物（OCCC），并估计卵子成熟度，回收到2个和2个以上卵子并且成熟卵子比例超过50%者包含于该研究中。取卵日收集精液标本，采用梯度离心法和上游法优化处理、制备精滴，用于加入卵子，适时观察卵子受精率。卵子的受精率是以出现2个原核的卵子占所有成熟卵子的比例来计数。

2结果

2.1优选处理对精子顶体酶活性的影响

优选处理前的精子顶体酶活性低于48.2υIU／106精子；经过精子优化处理，本文中的93例患者经过超促排卵、体外受精后，共92个（%）IVF周期受精成功，受精率为98.9%。

2.2优选处理前的精子顶体酶活性与IVF受精率的关系（相关性分析）

优选处理前精子顶体酶活性与IVF受精率无明显相关性，本文中93例顶体酶低下患者中，只有1例患者受精障碍。单纯顶体酶低下患者，IVF受精率与此无明显相关性。

2.3优选处理后IVF受精率

优化处理后，本文93例患者精子密度达到2-3×106／ml,活动力a+b达到90%以上，精子正常形态在4%以上，IVF受精率在98.9%。

3讨论

精子顶体酶是存在于精子顶体膜相连的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，以酶原的形式合成并储存在顶体内。它是受精过程中的一种重要的蛋白水解酶，为精卵结合提供条件，顶体反应开始后，顶体酶原被激活成顶体酶并被释放出来，溶解透明带，通过精子的强烈的活动力及楔样作用协助精子穿透透明带。ReichartM等人认为精子顶体酶活力是一个很好的男性生育能力的指示因子。顶体酶活性低下会影响对卵细胞卵丘的分解及对透明带的穿透，顶体酶活性是判断精子生育力很有价值的一项指标。

精子顶体酶以无活性的酶原形式——前顶体酶存在于精子头部的顶体基质和内膜上，精子获能和精子与透明带结合发生顶体反应时，精子前顶体酶从顶体内释放出来并活化为顶体酶，在精子与卵母细胞作用的早期阶段，精子需与透明带相互识别，精子识别并穿透卵母细胞透明带是受精过程的关键，研究发现精子顶体酶／前项体酶可能参与精子与透明带的第二次结合和水解卵母细胞透明带，它对于人类正常的受精很重要，当精子顶体酶活性减少、缺乏或受抑制，精子将不能结合和穿透卵母细胞透明带。一些研究证明精子顶体酶活性降低可能与男性生育力低下和不育有关，并有望将精子顶体酶活性作为在辅助生殖中反映男性精液生育能力的精子功能学指标。本研究采用改良Kennedy法使精子前顶体酶体外活化为顶体酶后参与IVF受精过程，并与IVF受精率联系。结果证明，优选处理后由于有效地去除了精液中的白细胞、生精细胞、死精子、畸形精子等成分，提高精子活力，并使精子获能，IVF受精率水平明显高于IVF受精标准。Michel等的研究发现较低的精子顶体酶活性与IVF受精率降低有关。在本研究中，精子经优化处理后，IVF平均受精率为(33.3～100)％，在IVF治疗周期，根据优选处理后的精子密度按一定比例加卵，因此优选处理后的精子顶体酶活性在精子结合和穿透卵子透明带过程中直接发挥作用，影响IVF受精率，提示精子顶体酶活性降低可能导致IVF受精率降低。

我们采用体外改善精子质量，IVF受精率明显提高。单纯顶体酶低下患者，精子经优选处理后，并不影响IVF受精率，单纯顶体酶低下患者只能为临床选择IVF还是ICSI治疗提供参考，不能作为临床IVF或ICSI受精方式的选择。在辅助生育技术中，受精方式的选择仍需参考精子密度、活动力、精子正常形态及女方因素中的各种因素，选择最有利于患者的治疗方案。

参考文献

[1]MorrisID,IlottS,DixonL,BrisonDR.ThespectrumofDNAdamageinhumanspermassessedbysinglecellgelelectrophoresis(Cometassay)anditsrelationshiptofertilizationandembryodevelopment[J].HumReprod,2002,17:990～8.

[2]YamagataK,MurayamaK,OkabeM,etal.Acrosinacceleratesthedispersalofspermacrosomalproteinsduringacrosomereaction.JBiolChem，1998，273(17):10470-10474.

[3]Kirkman-BrownJC,PuntEL,BarrattCL,etal.Zonapellucidaandprogesterone-inducedCa2+signalingandacrosomereactioninhumanspermatoaoa.JAndrol，2002，23(3):306-315.