AD模型大鼠神经生长因子及c-fos表达相关性的研究

AD模型大鼠神经生长因子及c-fos表达相关性的研究

姚宏波孙丽慧廉洁刘丹阳(通讯作者)

姚宏波孙丽慧廉洁刘丹阳(通讯作者)（齐齐哈尔医学院组胚教研室161006）

【中图分类号】R651【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）50-0242-02

【摘要】目的探讨AD模型大鼠海马神经元NGF及c-fos的相关性。方法60只大鼠随机分成五组，正常组、模型组、模型对照组、西药组和电针组。用免疫组化法检测NGF及c-fos蛋白的表达，采用统计学和ISPSS11.5软件进行图像分析。结果电针组NGF含量高于模型组，c-fos蛋白含量低于模型组。电针可使大鼠海马NGF的表达增强，同时c-fos蛋白的表达降低。结论可能电针的刺激对c-fos和NGF表达之间有一定的相关性。

【关键词】阿尔茨海默病电针NGF、c-fos

阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)是以损害大脑记忆和认知功能为主，同时伴有精神行为异常的一种中枢神经系统退行性疾病。神经生长因子(nervegrowthfactor，NGF)是发现最早的一种神经营养因子。探索NGF的表达机理对于治疗神经损伤和神经元退变性疾病具有重要意义。近些年来发现即早基因c-fos是第三信使之一，在神经损伤，脑缺血等疾病及AD模型中均表达活跃。c-fos在生理及病理性刺激时能被快速诱导，在将细胞外信号转变为长期持久的细胞表现型的改变中起作用[1]。研究发现，在NGF基因内存在c-fos蛋白的结合位点。但c-fos是否与NGF的表达有相关性，目前尚无详细的报道。故本文研究了电针对老年痴呆模型大鼠海马中c-fos与NGF的表达特点，为进一步研究NGF的作用机制提供参考。

1材料与方法

1.1AD模型的建立雄性Wistar大鼠，8～9月龄,体重(220±20)g,经10%水合氯醛麻醉后，固定于脑立体定位仪。暴露硬脑膜，每侧侧脑室注射10%链脲霉素10µl。坐标参考文献：前囟1.5mm,矢状缝左右旁开1.5mm,脑表面下3.5mm。术后水迷宫试验。全部实验动物用相同的饲料喂养，喂养过程中所使用的器皿均为非铝制品。

1.2动物分组及处理正常组：不做任何处理，常规饲养；模型对照组：每侧侧脑室各注射10µl生理盐水替代链脲霉素；模型组：每侧侧脑室各注射10%链脲霉素10µl，第三天重复注射；西药组：造模后用氢溴酸加兰他敏每日0.5～１mg/kg灌胃，治疗30天；电针组：造模后用毫针针刺“百会”穴，平刺约2.5mm，“大椎”穴，直刺约4mm。连接KWD-808Ⅱ型全能脉冲电疗仪，频率为30Hz，电压为2V。针刺大鼠双侧“太溪”穴，直刺进针3mm，双侧“肾俞”穴，直刺进针5mm，双侧“足三里”穴，直刺进针4mm，间歇5min捻转一次。每日1次，时间30min。一疗程为10天，间歇一天，治疗三个疗程。

1.3免疫组化

1.3.1程序c-fos和NGF均为多克隆抗体,其稀释度为1∶100;Rb-Sp(SantaCruz公司,北京中山公司分装)。试剂盒中的生物素化二抗和SP复合物稀释度均为1∶100。按常规SP法进行,暴露抗原方法略有不同:c-fos为0.1%胰蛋白酶，37℃,18～20min;NGF为0.01%mol/L柠檬酸缓冲液，pH为6.0,微波处理两次,每次5min。阴性对照:省去所有一抗,结果为阴性。

1.3.2结果判断根据显色的强弱,将染色结果分为四级:-为阴性,+为弱阳性,++为中等阳性,+++为强阳性。

1.4数据处理采用统计学分析和SPSS11.5软件进行图像分析。

2.结果

正常组在海马结构内c-fos蛋白几乎没有阳性细胞表达，模型组阳性表达明显,细胞核表达染成棕褐色，西药组、电针组阳性表达相对模型组减少，散在分布，治疗后西药组、电针组与模型组比较有显著性差异；正常组的海马区有广泛的神经元呈NGF免疫反应强阳性，模型组有少量的神经元呈弱阳性，治疗后海马各区神经元呈强阳性。

表1海马CA1区c-fos和NGF的表达

与正常组比较，＊P<0.01；与模型组比较，＊＊P<0.05

3.讨论

对AD的治疗，目前尚缺乏有效的治疗方法。近一个世纪的探索，用于AD的治疗药物达几十种，这些药物多属于对症支持治疗，虽然在一定程度上可以改善患者的的认知能力、延缓衰老，但大多具有疗效不稳定、毒副作用大、价格昂贵等缺点。近年来对针灸治疗AD的机理研究取得了一定进展。随着分子生物学在中医药学领域应用的发展，针灸治疗AD的分子生物学机理的研究也取得了一定的成果。随着我国人口老龄化的加速，寻求一种能够促进脑内内源性NGF生物合成的简便、安全、有效的治疗方法己成为社会的迫切需要。已有报道显示，针刺能通过对NGF的表达促进脊髓损伤后神经元可塑性的变化[2]，本实验也证实了，电针可以增强NGF的表达。

关于即刻早期基因c-fos的研究为解释针灸促进内源性NGF生物合成的机制提供了重要线索。多种刺激因子,如缺氧、光刺激、机械刺激、疼痛刺激等均可诱导中枢神经系统的c-fos基因的表达[3]。NGF具有营养和保护胆碱能神经的作用，能有效对抗AD所致的胆碱能神经的溃变。c-fos基因的表达和fos蛋白的合成，可以启动和调控神经元某些具有特殊功能靶基因的表达，其中就包括NGF的表达[4]。在本课题中发现，电针治疗可以降低c-fos的表达，并使NGF表达增强。可能电针的刺激和药物的诱导对c-fos和NGF表达之间有一定的相关性。

参考文献

[1]龙双涟，吴良芳，保天然.部分去背根传入猫脊髓Ⅱ板层神经生长因子的免疫组化研究.神经解剖学杂志,1997,13(4):362～366.

[2]黄诚，陈汉平.针灸治疗老年性痴呆概况.中国针灸,1997,l:61～63.