正清风痛宁肠溶片在Beagle犬体内的药动学和生物等效性

正清风痛宁肠溶片在Beagle犬体内的药动学和生物等效性

邹泽黄晓宏袁建平李飞

邹泽黄晓宏袁建平李飞（重庆市黔江中心医院409000）

【中图分类号】R965【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）04-0058-03

【摘要】目的探讨正清风痛宁肠溶片在Beagle犬体内药动学和生物等效性。方法选用10只Beagle犬单剂量随机交叉口服正清风痛宁肠溶片受试制剂或参比制剂10mg?kg-1，用高效液相色谱法测定血药浓度，3p97软件计算药动学参数和生物等效性评价。结果受试制剂与参比制剂的药-时曲线呈一室模型，主要药动学参数Tmax分别为（86.25±10.61）min和（75.00±16.04）min，Cmax分别为（0.18±0.038）μg?mL-1和（0.18±0.042）μg?mL-1，t1/2ke分别为（78.34±15.21）min和（88.77±30.90）min，AUC0-T分别为30.31±7.82μg?min?mL-1和（32.09±8.61）μg?min?mL-1，受试制剂相对生物利用度为（94.45±5.49）%。结论经方差分析、单双侧t检验和非参数统计检验，表明受试制剂与参比制剂具有生物等效性。

【关键词】正清风痛宁肠溶片高效液相色谱法药动学生物等效性

正清风痛宁肠溶片具有抗炎抗风湿、免疫抑制、镇静、镇痛的作用，已广泛应用于临床[1]。该制剂是从传统治疗风湿性疾病中药清风藤中提取的一种单体成分青藤碱(sinomenine)。此外，青藤碱还有注射剂、缓释制剂等。有关青藤碱的药动学已有文献报道[2-4]，但其肠溶片在Beagle犬体内的生物利用度和生物等效性未见文献报道，现将研究结果报道如下，供临床医生参考。

1材料

1.1仪器

Angilent1100高效液相色谱仪，PhenomenexGeminiC18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；PHS—3C酸度计(上海精密科学仪器有限公司)；VXH—3型快速混合器(上海跃进医疗器械厂)；B160A型医用低速离心机(河北省安新县白洋离心机厂)；BP61型电子天平(德国Sartorius公司)。

1.2药品和试剂

受试制剂，正清风痛宁肠溶片(商品名为正清风痛宁片)，西安利君制药有限责任公司生产，规格：20mg／片，批号0707291。

参比制剂，正清风痛宁肠溶片，湖南正清制药集团股份有限公司生产，规格：20mg／片，批号0803103。

青藤碱标准品，西安赛邦医药科技有限公司，白色结晶粉末，无臭，味苦，易溶于水，溶解于乙醇，纯度98％，批号20070402。

内标物，去水吗啡，沈阳第一制药厂，规格为5mg﹕1mL，批号20020613。

二氯甲烷为色谱纯，其余试剂均为分析纯。重蒸水(重庆医科大学附属医院药剂科)。

1.3动物

健康Beagle犬10只，体重10±0.8kg，雌雄各半，四川养麝研究所提供，质量合格证号和环境设施合格证号分别为川实动管第63号和第64号。

2方法

2.1给药方案与血样采集

采用双周期自身交叉设计，10只Beagle犬，雌雄各半，随机分为两组，每组5只，分别口服受试制剂或参比制剂，1周后交叉给药。试验前禁食12h后，根据人与动物用量转换剂量[5]，于次日晨8时空腹灌服受试制剂或参比制剂10.0mg?kg-1，于给药后0，15，30，60，90，120，240，480min，从前肢静脉取血2mL，分离血浆，低温保存（-20℃）待测。

2.2血药浓度测定方法

2.2.1色谱条件PhenomenexGeminiC18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为甲醇-0.01mol?L-1磷酸二氢钠-三乙胺(55﹕45﹕0.1，调pH至7)，流速0.8mL?min-1；内标去水吗啡；检测波长262nm；柱温30℃；进样量50μL。

2.2.2青藤碱标准溶液的配制精密称取青藤碱对照品适量，用甲醇溶解并定容，配成300μg?mL-1的储备液,于4℃保存。临用前，用犬空白血浆按倍数稀释法稀释至所需浓度，即得青藤碱的标准工作液。

2.2.3内标液的配制取一支去水吗啡液（5mg﹕1mL），加甲醇配成200μg?mL-1的储备液，于4℃保存。临用前，加水稀释成40μg?mL-1，即得内标工作液。

2.2.4样品处理取血浆样品0.4mL，加入内标去水吗啡50μL（40μg?mL-1），混合均匀，并加入二氯甲烷4mL，漩涡混匀1min后置3500r?min-1离心5min，静置分层。取二氯甲烷层清液，50℃水浴中氮气吹干，流动相复溶100μL，每次进样50μL。

2.3数据处理

采用3p97计算机软件选择最佳药代动力学模型，计算药动学参数。口服给药的Cmax、Tmax用实测值表示；AUC0-T用梯形法计算，口服给药的生物利用度F=×100%。

3结果

3.1特异性

在选定的色谱条件下，青藤碱和内标物质峰形好，与血浆中内源性物质及其他杂质分离良好，见图1，图A、B、C、D分别为青藤碱+去水吗啡对照品溶液，空白血浆，空白血浆+青藤碱+去水吗啡对照品，Beagle犬给药1h后血浆样品。

t/min

（A）（B）（C）（D）

图1青藤碱HPLC图

Fig1.Chromatogramsofsinomenine

A.青藤碱+去水吗啡对照品溶液；B.空白血浆；C.空白血浆+青藤碱+去水吗啡；D.给药1h后血浆样品

A.referencesubstandsolution;B.blankplasma;C.blankplasma+sinomenine+dehydratedmorphine

D.plasma1hafteroraladministrationof10mg?kg-1

1.青藤碱2.去水吗啡（内标）

1.sinomenine2.dehydratedmorphine(internalstandard)

3.2标准曲线、线性范围和最低定量浓度分别取青藤碱储备液适量及犬空白血浆，制成质量浓度为90，45，22.5，4.5，0.45，0.045，0.0075μg?mL-1的青藤碱血浆样品，按2.2.4项下方法

处理进样，所得数据以血浆中青藤碱的浓度X对青藤碱与内标的峰面积比值Y进行线性回归，得血浆中青藤碱的标准曲线为Y=0.3920X+0.7052（r=0.9991）。结果表明，青藤碱检测浓度在0.0075-90μg?mL-1范围内线性关系良好，最低定量浓度为0.0075μg?mL-1（n=5，RSD=9.23%）。

3.3回收率和精密度

取青藤碱储备液适量及犬空白血浆，制成高、中、低3种不同浓度（45，4.5，0.045μg?mL-1）样品，按2.2.4项下方法处理，评价本法的方法回收率与萃取回收率（含药血浆经样品处理所得测定值与同时用流动相配制的同浓度标准溶液测定值计算萃取回收率）及日内（每个浓度1日内测定5次）、日间精密度（每个浓度连续测5d，每天测1次），见表1。

表1回收率及精密度测定结果(n=5)

Tab1Resultsofrecoveryandprecisiontests（n=5）

3.4稳定性

室温稳定性试验：取中浓度（4.5μg?mL-1）血浆样品，室温放置,于24h内测定3次，结果表明室温放置24h内稳定性良好(青藤碱：4.42±0.20μg?mL-1，RSD=4.52%)。

冷藏稳定性试验：取中浓度（4.5μg?mL-1）血浆样品，冷藏（4℃）放置,于6日内测定5次，结果表明冷藏放置6日内稳定性良好(青藤碱：4.68±0.23μg?mL-1，RSD=4.91%)。

冻融稳定性试验：将含药血浆反复冷冻(-20℃)、溶解，按样品处理后测定,3日内测定3次，测得青藤碱质量浓度分别为0.12，0.13，0.12μg?mL-1，结果表明血浆样品3日内反复冻融测定稳定性良好(0.12±0.0058μg?mL-1，RSD=4.8%)。

3.5血药浓度测定结果

10只Beagle犬按10.0mg?kg-1量单次口服受试制剂或参比制剂后的血浆按2.2.4项下方法处理后，以青藤碱峰面积与内标峰面积之比值代入标准曲线计算血药浓度，平均药-时曲线见图2。

图2受试制剂与参比制剂的平均药-时曲线

Fig2.Meanplasmaconcentration—timecurvesofreferenceandtestpreparation

3.6药动学参数与相对生物利用度

Beagle犬按10.0mg?kg-1量口服受试制剂或参比制剂在体内的药-时数据拟合后均为一室开放模型，其药动学参数见表2。受试制剂的相对生物利用度为（94.45±5.49）%。

表2受试制剂与参比制剂在犬体内的主要药代动力学参数（x-±s，n=10）

Tab2Meanpharmacokineticparametersofreferenceandtestpreparationinbeagledogs（x-±s，n=10）

注：Cmax*、Tmax*为实测值

3.7生物等效性评价

采用各受试制剂或参比制剂的AUC(0-T)分别计算相对生物利用度(F)[3]。受试制剂的F为(94.45±5.49)%。相对生物利用度主要参数AUC(0-?)、AUC(0-T)和Cmax经方差分析，个体间有显著差异（P<0.05），而两药间无差异(P>0.05)；双单侧t检验三者两药间的t1分别为7.8283.568和2.213，t2分别为12.941、9.441和2.553，结果判断均等效；（1-2α）置信区间法统计分析三者的置信区间分别为90.8%-98.7%、84.6%-96.7和82.1%-118.1%，均等效。

4讨论

文献报道，血浆内青藤碱采用高效液相色谱法检测，选用氯霉素[6]、三唑仑[7]和氨基比林[8]作内标，初步试验不理想。经分析青藤碱结构，选用类似物吗啡作内标；流动相中磷酸二氢钾换为磷酸二氢钠，调试比例为甲醇：磷酸二氢钠（55：45），结果稳定，操作方便，简单易行，完全能满足本研究条件。

青藤碱在家兔、Beagle犬体内药动学参数已有文献报道[2-4]。本研究结果所得药动学参数与文献报道相类似。在Beagle体内受试制剂与参比制剂AUC(0-T)分别为30.31±7.82与32.09±8.61μg?min?mL-1，受试制剂的F为(94.45±5.49)%，与文献报道相类似。试验结果表明，青藤碱口服易于吸收，受试制剂与参比制剂生物等效。

参考文献

[1]孔庆峰，李军．青藤碱研究新进展[J]．中国中药杂志，2005，30(20)：1575．

[2]张斯汉，周远大，何海霞．正清风痛宁肠溶片的生物等效性研究[J]．中国中药杂志，2008，33(6)：684．

[3]陈万一，周远大，康纪平等.青藤碱在Beagle犬体内的药动学和绝对生物利用度[J].中国中药杂志，2009，34（3）：1-4.

[4]王柯静，周远大，何海霞等.正清风痛宁肠溶片在Beagle犬体内的药动学及绝对生物利用度研究[J].中药药理与临床，2008，24（6）：19.

[5]徐叔云，卞如廉，陈修等.药理实验方法学[M].人民卫生出版社，2002，P22.

[6]杨广德，刘军保，王志军，等．反相高效液相法测定血浆中青藤碱的含量[J]．中国药学杂志，1993，28(3)：152．

[7]张先洲，周延安，罗顺德，等．青藤碱凝胶剂的质量标准研究[J]．医药导报，2003，22(8)：571．

[8]杨广德，刘军保，王志军，等．高效液相色谱法测定人血清和尿中盐酸青藤碱浓度及药代动力学研究[J]．药学学报，1997，32(8)：620．