钩端螺旋体毒力因子研究进展

钩端螺旋体毒力因子研究进展

曾维诚1张英1，2

1.泸州医学院机能实验室；2.泸州医学院病理生理教研室四川泸州646000

【中图分类号】R377【文献标识码】A【文章编号】2096-0867（2016）-07-062-03

钩端螺旋体病（leptospirosis，简称钩体病）是由致病性钩端螺旋体（简称钩体）引起的钩端螺旋体病（钩体病）是一种全球性自然疫源性疾病，广泛分布在世界各地。我国是受钩体病危害十分严重的国家，目前已发现有18个血清群75个血清型，遍布31个省份，自1955年以来病例数超过250万人，平均病死率约为1%。

钩体病虽然已发现一百多年，但其致病机制至今尚未完全阐明。一般认为，钩体对机体的粘附和侵袭、其自身的运动性和趋向性以及其代谢产物等因素都与致病性相关。近年来，随着分子生物学手段、测序技术及生物信息学分析水平的提高，使得与钩体致病有关的毒力因子如脂多糖、溶血素、鞭毛蛋白、外膜蛋白等的研究取得了较大进展，本文就这些研究成果进行综述。

1．脂多糖（Lipopolysacchride，LPS）

钩体LPS能诱发家兔出现施瓦茨曼氏（Shwartzman）反应，给小鼠注射LPS能引起广泛性内脏出血，尤以肺出血更为严重，从而提示钩体病的肺弥漫性出血可能与LPS有关。钩体LPS能促进中性粒细胞与内皮细胞和血小板的黏附，造成血小板聚集，并引发血小板减少症。Isogai[1]等报道LPS可诱导小鼠淋巴细胞发生凋亡，并认为与LPS引起TNF-α的大量产生有关。近来，Nally[2]等发现在急性感染钩体的动物模型体内，钩体LPSO抗原的表达较慢性感染的动物体内和培养基中的少，由此可见，通过调节LPSO抗原的表达可以决定钩体感染后是引发急性感染亦或是慢性感染。

目前，我国和巴西的科学家已分别完成了问号钩体黄疸出血群赖型赖株和哥本哈根型的全基因组测序工作，并对这两型基因组进行了比较分析[3]。对基因组的分析发现钩体LPS合成和装配相关基因共有23～31个。钩体间基因的差异被认为是钩体对不同的动物宿主的适应性和钩体型特异性的原因。因此，对LPS的进一步研究，可能有助于揭示钩体血清型特异性及多样性的分子机制。

2．溶血素（Hemolysin）

钩体产生的溶血素分为两大类：鞘磷脂酶C类溶血素和成孔蛋白类溶血素。到目前为止鞘磷脂酶C类溶血素仅在致病性钩端螺旋体中检测到，以sphA为代表。溶血素基因sphH编码的蛋白与绵羊红细胞在37℃混合作用20分钟后，在透射电镜下观察到红细胞膜上有小孔，电子云密度降低，细胞内容物渗漏，细胞形态改变，而阴性对照组则没有这种现象，证实这种溶血素具有成孔型性。

溶血素的作用是破坏红细胞或其他细胞膜，增加毛细血管的渗透性，使血管壁破裂造成皮下出血，这可能是钩体感染宿主后造成机体组织器官的病变，特别是毛细血管壁的渗漏、溶血性贫血以及致命性肺弥漫性出血的一个重要原因。此外，溶血素对钩体的生存也是必须的，钩体不能自身合成生长所必需的碳源和能源，而且也不能在无金属离子的培养基中生长，这些物质必须要靠外界供给。溶血素破坏红细胞膜使其裂解释放出游离脂肪酸和金属离子，供其自身生长需要。同时，溶血素可能还有助于钩体在宿主体内的存活。

晚近，通过对问号钩体黄疸出血型赖株基因组CDs的分析，已发现11个可疑的溶血素基因，均分布在钩体大染色体上。除了LA0177的氨基酸序列较短，没有磷酸酯酶结构域外，其余基因根据其所编码蛋白的功能可分为2类：鞘磷脂酶类和非鞘磷脂酶类即成孔蛋白类溶血素基因。其中的9个基因已在大肠杆菌BL21plysS克隆表达并成功地验证了它们的溶血活性[4]。但是这些基因是否在宿主体内表达以及其在体内的溶血活性和细胞毒性如何，尚需实验验证。

3．鞭毛蛋白（Flagellin）

钩体的鞭毛附着于钩体的两个亚末端，通过其在胞浆中的旋转导致菌体的运动。从钩体细胞中分离的鞭毛经双向凝胶电泳显示，鞭毛由分子量介于31.5-36kDa的7种蛋白组成。其中最为重要的蛋白是FlaA、FlaB，两者相互作用影响鞭毛的螺旋结构。

为了研究鞭毛在钩体致病中的作用，以Brachyspirahyodysenteriae作为模型，用等位交换基因突变分析其功能，构建flaA：：cat、flaA：：kan、flaBl：：kan、flaB2：：cat和flaB3：：cat突变体，观察这些突变体是否可以导致运动能力的丧失并改变鞭毛的结构来研究纯化的鞭毛功能。结果发现，上述突变体的运动能力仍然存在，但是其运动能力均比野生株弱[5]。PicardeauM[6]等用穿梭质粒作为自杀置换体定向灭活双曲钩体的flaB基因，结果观察到突变体鞭毛缺如，运动能力丧失，表明FlaB参与鞭毛的组装及菌体移动。钩体鞭毛还作为抗原刺激T、B淋巴细胞应答。赖型钩体基因组中预测的4768个基因中有50余个基因所编码的蛋白可能与钩体鞭毛的生物合成有关，这50余个基因均分布在钩体大染色体上。

4．外膜蛋白

外膜蛋白（Outermembraneproteins，OMPs）种类繁多，在钩体粘附、免疫和致病中意义重大。较为重要的有以下几种。

4.1OmpL1

目前发现，OmpL1是钩体唯一的跨膜蛋白，由320个氨基酸组成，分子量31kDa。OmpL1在致病钩体表达的保守性和位于菌体表面，使其有可能成为有效疫苗和诊断抗原的候选者。尽管单独使用含有重组OmpL1的大肠杆菌膜片段主动免疫金黄地鼠，对同种钩体Kirsehneri基因种RM52无显著的保护作用，但使用含有重组OmpL1和LipL41的大肠杆菌膜片段免疫后却出现了明显的保护作用[40]。Maneewatch等[7]用编码问号钩体黄疸出血群哥本哈根型OmpL1基因的质粒DNA疫苗（ompL1-pcDNA3.1+）免疫仓鼠，表明OmpL1DNA疫苗可提供抗异种钩体的交叉保护作用。免疫印迹试验显示重组OmpL1具有良好的抗原性，ELISA表明重组OmpL1可与感染同型钩体的血清发生强烈反应，提示该蛋白可作为广普疫苗和免疫诊断抗原的候选者[9]。ReitstetterRE[10]等亦有类似的报道，可见OmpL1在钩体病的诊断和预防上具有一定的价值。

4.2LipL32

LipL32也称为Hap-1，由272个氨基酸组成，分子量为32kDa，其结构基因含816bp核苷酸，是钩体中含量最多的表面暴露脂蛋白，除自身具有溶血活性外，还能调节溶血素HlyX，促进溶血[11]。Yang[12]等发现LipL32的重组体可以刺激近曲小管上皮细胞通过诱导NF-κB、AP-1转录，促进iNOS、TNFα和MCP-1的分泌，而LipL32的抗体可阻止这一反应，提示LipL32通过NF-κB介导的通路，引起肾小管上皮细胞损伤，引发肾小管间质性肾炎。进一步研究证实[13]，重组的LipL32可诱导小鼠肾小管上皮细胞TLR2受体表达上调，伴有iNOS、MCP-1产生增加，抗TLR2受体的抗体可以阻断LipL32引起的iNOS、MCP-1mRNA表达增加，表明LipL32通过TLR2受体诱导了的小鼠肾小管上皮细胞炎症介质的释放，可能是引起肾小管间质性肾炎的一个重要毒力因子。

对LipL32免疫保护作用的研究一直深受重视，2001年Branger[14]等以腺病毒作为载体，制备含有LipL32的疫苗，免疫动物后可保护动物对抗异种有毒钩体的攻击，随后，为消除腺病毒的不良影响，他们以真核质粒为载体，构建DNA疫苗免疫沙鼠，发现免疫鼠可耐受三种不同型别钩体的攻击，提示LipL32（Hap-1）可以在沙鼠体内诱导交叉免疫保护反应[15]，但有趣的是，重组LipL32蛋白却不能诱导明显的保护性免疫。最近，Seixas[16]等用表达LipL32的重组卡介苗免疫仓鼠，再用致死剂量的问号钩体哥本哈根型攻击，尸检和组织学检查表明接种重组卡介苗后，在注射了钩体的动物体内没有找到发生钩体病的证据，进一步证实了LipL32的免疫保护效应。

迄今，在钩体感染的病人中已发现了7种与感染有关的蛋白，其中免疫印迹实验表明，LipL32的抗体IgG在急性期和感染期病人血清中分别占37%和84%，具有很强的特异性和敏感性，提示LipL32可作为诊断钩体病的候选抗原。实际上，已有多个研究证实了LipL32的诊断价值[17，18]。

4.3LipL21

LipL21是一种新型表面暴露性脂蛋白[19]，该蛋白在问号钩体赖型赖株外膜蛋白中的含量仅次于LipL32。LipL21无论在体内还是体外、是否缺铁以及不同温度条件下均表达。Southern杂交显示，LipL21存在于所有致病菌株，而在被检的非致病菌株中均未发现，提示LipL21是钩体的又一毒力因子。

4.4LipL41

LipL41由355个氨基酸组成，分子量为41kDa，结构基因含1065bp核苷酸。LipL41在动物感染时表达上升，且免疫沉淀试验显示其暴露于外膜表面[20]。晚近发现LipL41还具有结合氯化高铁血红素的能力，这可能对钩体的生长有一定的作用。免疫保护实验证实，以LipL41或OmpL1单独免疫不能产生有效的保护作用，但两者共同免疫时，免疫保护率明显提高，由此可见LipL41与OmpL1有协同免疫保护作用[21]。

4.5LipL36

LipL36的OFR含1092bp核苷酸，编码364个氨基酸，分子量36kDa。在钩体生长培养过程中，LipL36的表达量不同。在对数生长早期LipL36表达量最大，是钩体中表达最丰富的蛋白之一，但从对数生长中期开始，LipL36表达水平显著下降。LipL36是温度调节蛋白，在30℃时，钩体合成LipL36，但在37℃，钩体则不表达此蛋白。值得注意的是，LipL36在动物感染中表达下调[22]，这可能与钩体的慢性感染机制有关，钩体通过下调外膜蛋白表达量逃避宿主的免疫反应，从而在宿主体内长期存活，因此该蛋白可能成为致病钩体适应宿主机制的标识分子[64]。

4.6Loa22

Loa22为含有195个氨基酸，分子量约22KDa的外膜脂蛋白，一小部分暴露于钩体表面，其C末端与OmpA结构域同源。有人[23]将转座子Himarl插入Loa22基因序列中，构建loa22缺陷的突变体，结果发现感染突变体的动物体内没有Loa22蛋白的表达，同时钩体引起的毒性反应较野生株弱，若在突变体中转入loa22基因，不仅感染动物体内出现Loa22蛋白的表达，而且引起突变株的毒力恢复，提示Loa22是钩体感染宿主所必须的毒力蛋白。晚近，Zhang等[24]研究表明，重组的Loa22蛋白可引起培养的肾小管上皮细胞释放NO、MCP-1等炎症介质，提示该蛋白可能在钩体引起的小管间质性肾损害中起到了重要作用。Nally[22]等对从宿主体内分离的钩体进行蛋白组学分析显示，不仅该蛋白在宿主感染期间表达，而且表达量显著增加。已知感染宿主时表达的蛋白质在钩体病的发病机制中可能起决定作用，同时可作为宿主免疫反应的靶蛋白，因此，对Loa22的致病作用、免疫保护、诊断价值有待进一步研究。

4.7LipL46[25]

这是最新发现的一种外膜蛋白，由412个氨基酸组成，分子量为46KDa，含有21个氨基酸组成的信号肽。它可溶解于TritonX-114，表明是一种脂蛋白。表面免疫沉淀和全钩体ELISA试验提示LipL46暴露于钩体表面，免疫组化证实急性感染钩体的仓鼠血流中的钩体可表达LipL46。LipL46还存在于受染仓鼠的肝细胞间隙及脾巨噬细胞内。该蛋白可被感染钩体的仓鼠的血清识别，表明它在感染期间表达。这些研究提示，LipL46在钩体的体内扩散过程中十分重要，可以作为一有用的血清学诊断抗原。

4.8OmpL17[26，27]

鲍朗等应用抑制消减杂交技术，从赖型钩体017株中筛选出致病钩体赖型017株特有的、而非致病钩体缺失的差异基因片段，半巢式PCR扩增差异基因片段相邻两侧未知序列，获得1020bp的DNA片段，测序并经生物信息学分析表明其包含一完整读码框，编码的蛋白是外膜蛋白，已登录在GeneBank，命名为OmpL17。以其构建重组表达载体在大肠杆菌中表达出约28KDa的蛋白，该蛋白可以诱导豚鼠产生高滴度的特异性抗体，表明OmpL17具有良好的免疫原性。以基因打靶技术研究OmpL17功能，证实OmpL17是赖型钩体的一个毒性蛋白，因为灭活该基因的突变株的致病力较野生株有明显的减弱。

4.9钩体免疫球蛋白样蛋白

钩体免疫球蛋白样（Lig）蛋白是暴露在表面的外膜脂蛋白，含有一串约90个氨基酸的串连重复序列，同源性分析表明，该重复区域与多种细菌的Ig类似。其中LigA仅含Ig样区域，而LigB在C末端还有一独特非重复区域[28]。Lig基因存在于各种致病性钩体，而非致病性钩体则没有，而且Kirshneri钩体和问号状钩体减毒后不表达Lig蛋白和LigmRNA，提示Lig蛋白与毒力有关[28]。钩体免疫球蛋白样蛋白结构域与多种细菌的黏附蛋白结构域同源，Choy等[29]发现渗透压升高诱导Lig表达时伴有钩体黏附到胞外基质和胞浆蛋白（如胶原Ⅰ、Ⅳ、层连蛋白，尤其是纤维连接蛋白和纤维蛋白原）的能力增加，而且钩体对纤维连接蛋白的黏附可被重组的LigA、LigB阻断，提示LigA、LigB与钩体黏附宿主相关，可能参与了钩体病发病过程中钩体的最初定植和体内扩散。

Lig基因序列在致病钩体高度保守；哺乳动物感染钩体时，Lig蛋白表达增强；感染不同血清群钩体的病人血清可与Lig蛋白反应；在钩体豚鼠模型中，Lig蛋白能诱导针对同源马尼拉型和异源黄疸出血型的保护性免疫，这些结果提示，Lig蛋白尤其是LigA能诱导抗各种血清型钩体的保护性免疫[30]。最近的研究显示，ligADNA疫苗也可产生明显的免疫保护作用，该保护作用既有体液免疫的参与，又有细胞免疫的介导[31]。由此可见，用Lig制备疫苗可能具有良好的应用前景。

展望2001年，我国完成了钩端螺旋体黄疸出血型赖株的全部基因组DNA的序列分析和初步功能研究。预测其含有4768个基因，其中已知功能的基因不到50%，随着生物信息学的发展，将有更多基因的功能被发现，如宋卫峰[32]等利用生物信息学技术预测到黄疸出血群赖型赖株有两个基因可能编码降解蛋白质、肽链及糖肽的金属蛋白酶，这类酶是某些病原菌如炭疽杆菌、艰难梭菌等的毒性因子，提示它们可能是钩体新的致病基因。因此，不断对未知功能基因进行注释和结构预测，可以发现新的致病基因，有助于钩体致病机制的最终阐明，促进现有钩体疫苗的改善和新疫苗的研制，这将是今后钩体病研究的重要方向。

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