50例胃肠道间质瘤中c-kit基因突变的检测及意义

50例胃肠道间质瘤中c-kit基因突变的检测及意义

张薇珊成元华张著学

张薇珊1成元华2张著学3

（1四川省遂宁市中心医院病理科629000）

（2贵阳医学院附属医院病理科550004；3贵州省人民医院病理科550004）

【摘要】目的探讨c-kit基因在胃肠道间质瘤（GIST）中的突变状况。方法用PCR扩增和直接测序的方法,检测50例GIST中c-kit基因11号外显子突变。结果50例GIST中c-kit基因突变率为54.0%。不同侵袭危险组、部位、年龄组、性别、组织学分型、有无坏死及是否浸润至邻近器官等之间比较c-kit基因突变率均无显著性差异（P＞0.05）。结论c-kit基因突变参与了部分GIST的发生。

【关键词】胃肠道间质瘤c-kit基因聚合酶链反应突变

【中图分类号】R730【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）29-0097-02

胃肠道间质瘤（gastrointestinalstromaltumor,GIST）是人类胃肠道最常见的间叶源性肿瘤，c-kit基因及血小板衍生生长因子受体A（platelet-derivedgrowthfactorreceptoralpha,PDGFRA）基因突变是GIST发生的分子生物学基础[1]。

1材料与方法

1.1材料收集遂宁市中心医院病理科2000年1月—2012年1月的胃肠道间质瘤50例，标本均为10%的福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋,HE染色，两位熟练病理医师复习切片。

1.2免疫组化采用SP法，实验常规设置阳性对照及阴性对照，部分使用内对照。CD117、CD34、SMA、S-100、Desmin购自Dako公司，SP试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。CD117、CD34阳性染色定位于细胞质和（或）细胞膜，SMA、Desmin定位于细胞质，S-100定位于细胞质和（或）细胞核。

1.3诊断标准50例GIST中，48例CD117阳性而确诊，2例CD117阴性者有1例因CD34阳性，SMA、Desmin和S-100蛋白阴性而确诊，1例CD117阴性者因SMA、Desmin和S-100蛋白均阴性,排除了平滑肌源性和神经源性肿瘤,形态符合GIST而纳入本研究。

1.4c-kit基因突变分析用蛋白酶K-酚-氯仿方法提取GIST组织DNA。用PCR扩增c-kit基因第11外显子,引物序列分别为11F-CCAGAGTGCTCT-AATGACTG，11R-ACCCAAAAAGGTGACATGGA，产物长236bp。PCR条件为:(1)95℃变性2min;(2)94℃40s,54℃退火40s,72℃35s;循环30～35次;(3)最后72℃延伸5min。扩增反应以双蒸水代替模板作为阴性对照。PCR产物在上海生物工程有限公司纯化并测序。有突变的病例再行反向测序证实,并与NCBI基因库c-kit基因序列进行比对。

1.5统计分析采用SPSS13.0χ2检验。P<0.05有统计学意义。

2结果

2.1GIST临床病理特征50例GIST中，男性30例，女性20例，男：女=1.5：1；年龄24～77岁，中位年龄55岁，发病高峰年龄60～69岁（35.0%）。肿瘤位于食道1例，胃23例，小肠12例，结肠5例，直肠2例，肠系膜4例，腹膜后3例。依据Fletcher2000年提出的GIST生物学行为分级标准[2],50例GIST包括极低度侵袭危险性2例,低度侵袭危险性11例,中度侵袭危险性15例和高度侵袭危险性22例。

2.2c-kit基因突变分析

50例GIST中27例检测到c-kit基因外显子11突变，突变率为54.0%；在48例CD117阳性的病例中，c-kit基因突变率达到了54.2%（26/48）；2例CD117阴性的病例，1例有突变。突变中均为杂合性突变，未见纯合性突变。突变形式有：16例缺失突变（59.3%），10例点突变（37.0%），1例缺失伴点突变（3.7%），突变集中在5′端累及密码子550～560的“热点”区。最常见的形式是5′端第557～558个密码子WK(Trp-Lys)的缺失，共16例;3例557密码子由TGG→GGT，即Trp557→Gly；1例557密码子由TGG→AGG，即Trp557→Arg;2例559密码子GTT→GAT，即Val559→Asp；1例559密码子GTT→GCT，即Val559→Ala;2例为560密码子点突变，由GTT→GAT，即Val560→Asp;1例574密码子由ACA→ATA，即Thr574→Ile;1例同时有点突变和片段缺失，第557位密码子第一个碱基T→G并557-559位点6bp碱基缺失。

2.3c-kit基因突变的临床病理联系:

依据Fletcher生物学行为分级标准,各组中c-kit突变比例分别为:极低度侵袭危险性组为100.0%(2/2),低度侵袭危险性组为45.5%(5/11),中度侵袭危险性组为40.0%(6/15)和高度侵袭危险性组为63.6%(14/22)。c-kit突变与肿瘤这种由极低-低-中度-高度侵袭危险度的递增无显著性差异（极低度侵袭危险组纳入低度侵袭危险组统计）。GIST患者不同性别、年龄组、肿瘤有无浸润、有无坏死、部位及组织学分型等指标中c-kit基因突变率比较均无显著性差异。

3讨论

c-kit功能获得性突变是GIST发生的重要机制，即使在无配体结合的情况下，KIT蛋白仍然能保持持续的自身酪氨酸蛋白激酶活性，从而激活下游的信号传导通路，导致肿瘤的发生发展[1-4]。

GIST最常见的突变是c-kit基因外显子11的突变，这些突变影响了KIT蛋白近膜区的功能。1998年,Hirota等[4]首次报道了人类GIST中出现c-kit基因外显子11（编码KIT近膜区）的突变，他们在6例GIST中发现5例外显子11突变。所有突变的KIT蛋白在没有配体SCF存在时也能被持续激活，说明在c-kit基因外显子11突变是功能获得性突变。关于GIST中外显子11突变的发生率各家报道差异很大，从20%～92%不等[2,4-6]，这可能与检测方法、组织处理及病例构成等有关。我们的实验中GIST外显子11突变率为54.0%（27/50），突变形式与文献报道相同。

由于不同研究者报道的c-kit基因突变率差异很大，有关c-kit基因突变与GIST临床病理特征之间的关系也很复杂，突出表现在c-kit基因突变与GIST分级的关系，结果不一致。有些研究显示c-kit基因突变主要发生于恶性GIST,良性GIST很少有突变。然而，有学者认为认为c-kit基因突变与组织学分型、生物学行为等无相关性。这些矛盾的结果使c-kit基因突变在提示良恶性时的作用变得非常有限。本实验中c-kit基因突变阳性率为54.0%（27/50），不同侵袭危险性GIST患者c-kit基因突变的比较无显著性差异。c-kit基因有无突变与肿瘤这种由极低-低-中度-高度侵袭危险性的递增无明显相关。Corless等[7]在对13例在尸体解剖或因其他疾病剖腹探查中偶然发现的直径＜1cm、表现为惰性生物学行为的GIST研究中发现，这些GIST中c-kit基因突变率高达85%，与具有不良生物学行为的GIST突变率相当，基本否定了c-kit基因突变与肿瘤大小和良恶性的关系，认为有c-kit基因突变可能是GIST的普遍现象，是GIST的早期事件。与此相似，本实验中1例直径＜1cm的GIST中有c-kit基因突变。此外，不同部位、年龄组、性别、肿瘤有无浸润、有无坏死及组织学分型之间c-kit基因突变率比较亦无显著性差异（P＞0.05）。

GIST对放疗和普通化疗均不敏感，主要采取手术治疗。目前，一种新型酪氨酸激酶受体阻滞剂—甲磺酸伊马替尼（imatinibmesylate，商品名为格列卫）被用于治疗手术无法切除、转移或复发的GIST取得了良好的治疗效果[3]。因此对GIST相关基因突变进行研究具有很重要的意义。

参考文献

[1]HenrichMC,CorelessCL,DuensingA,etal.PDGFRAactivatingmutationsingastro-intestinalstromaltumors[J].Science,2003,299:708-10.

[2]FletcherCD,BemanJJ,CorlessC,etal.DiagnosisofGastrointestinalstromaltumors:aconsensusapproach[J].HumPathol,2002,33:459-465.

[3]HenrichMC,RubinBP,LongleyBJ,etal.BiologyandgeneticaspectsofGastrointestinalStromalTumors:KITactivationandcytogeneticalterations[J].HumanPathol，2002，33:484-495.

[4]HirotaS,IsozakiK,MoriyamaY,etal.Gain-of-functionmutationsofc-kitinhumangastrointestinalstromaltumors[J].Science,1998,279:577-580.

[5]祃栋赫，张军.胃肠道间质瘤c-kit和PDGFRA基因突变检测及临床诊断意义[J].中华实验外科杂志，2011，28（3）：370-372.

[6]贺慧颖，方伟岗，钟镐镐，等.165例胃肠道间质瘤中c-kit和PDGFRA基因突变的检测和临床诊断意义[J].中华病理学杂志，2006，35：262-266.

[7]CorlessCL,McGreeveyL,HaleyA,etal.KITmutationsarecommoninincidentalgastrointestinalstromaltumorsonecentimeterorlessinsize[J].AmJPathol,2002,160:1567-1572.