高脂食物与乙醇对小鼠肝纤维化的建模研究

高脂食物与乙醇对小鼠肝纤维化的建模研究

董迪烽1余平1彭泽鸿1尹丽珠1李兵2

1.长沙医学院2013级本科临床6班湖南长沙410219；2.长沙医学院解剖学教研室湖南长沙410219

摘要：目的：研究高脂饮食和乙醇对肝纤维化的影响。方法：40只雄性小鼠随机分为4组，空白对照组小鼠自由饮水，予正常饮食，并予以CCL4皮下注射；高脂低酒精模型组小鼠，予高脂食物喂养，低容量酒精灌胃，并且予以CCL4皮下注射；高脂高酒精模型组小鼠，予大容量酒精代灌胃，予高脂食物喂养，并且予以CCL4皮下注射；高酒精模型组小鼠，予大容量酒精代灌胃，并皮下注射植物油并且予以CCL4皮下注射。观察各组建模动物的饮食、体重、皮毛，活动情况、精神状态的状态，用光镜观察肝纤维化病理情况，检测建模动物的各项生化指标，利用超声成影技术对大鼠肝纤维化程度进行观察。结果：高脂高酒精组的小鼠的体重一开始上升的较快，但是之后速度逐渐减慢，甚至呈下降趋势，hyp明显升高。

关键词：高脂食物；乙醇；肝纤维化；实验动物建模

1实验材料

18-20g的成年健康雄性小鼠40只，市售饮用白酒（四川省古郎酒厂有限公司生产的郎酒，酒精度45％），离心机，光学显微镜，高脂饲料（玉米粉94.5％+猪油5.0％+胆固醇0.5％），灌胃器，注射器，四氯化碳溶液。

2.实验方法

2.1实验动物的分组与处理

清洁级饲养，1周适应期后随机分为4组，分别给予以下处理：①空白对照组小鼠自由饮水，予正常饮食，并予以CCL4皮下注射；②高脂低酒精模型组小鼠，予高脂食物喂养；③低容量酒精灌胃1ml/100g，并且予以CCL4皮下注射④高脂高酒精模型组小鼠，予大容量酒精灌胃2ml/100g，予高脂食物喂养，并且予以CCL4皮下注射。

2.2标本采集及检测方法

2.2.1．标本的收集：隔夜禁食12h，不禁水，于次日获取全血标本后颈椎脱臼法处死小鼠。全血标本于4℃冰箱静置1h后3000r/min离心10min分离得到血清，用于血清学指标的检测。处死大鼠后立即取出肝脏，称取肝脏湿重，在肝脏最大叶距边缘5mm处取小块肝组织，10％甲醛溶液固定，石蜡包埋，病理切片，HE染色及天狼星染色（sirus），光镜观察。肝脏病理学：造模后不同组别、不同阶段的小鼠肝脏病理变化，包括脂肪变性、炎症，纤维化情况。肝组织病理学检测将取下的肝组织标本用4%多聚甲醛固定后，常规脱水，包埋，制作成5μm厚切片，HE染色，光镜下观察。HE染色由山东省立医院病理科专家盲法阅片，分别在低倍镜（×10）、高倍镜（×40）下观察肝组织的病理学改变。肝细胞脂肪变性的程度判断标准参照范建高及Elizabeth等[1，2]。

天狼星红染色（sirus）制作方法：先取出培养箱内的CFs培养板，取出爬片标记；再磷酸缓冲液（PBS）洗，5min×3次；接着用4%多聚甲醛固定15min；再用PBS洗，5min×3次；用天青石蓝液染5-10分钟；再用PBS洗5min×3次；接着苦味酸天狼星红液染15-30分钟；再用PBS洗5min×3次；继续苏木精复染5-10min；再用90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇脱水；接着用二甲苯透明，中性塑胶封固；最后倒置显微镜下观察结果并照相保存。染色结果I型胶原呈亮红色或黄色，III型胶原位于I型胶原的周边呈绿色。

2.2.2检测指标

2.2.2.1超声造影（CEUS）：经小鼠尾静脉以团注方式注射0.06ml微泡混悬液，后推注1.5ml生理盐水。

2.2.2.2生化指标取小鼠肝脏检测丙二醛（MDA），硫代巴比妥比色法川；谷胧甘肤，二硫对硝基苯甲酸法[3]；金属硫蛋白（MT），镐饱和原子吸收分光光度法川；羟脯氨酸（HYP）[4]。

2.2.2.3病理学指标取肝左叶同一部位组织，常规HE染色及Masson染色，光镜观察，并[5]肝组织常规脱水、包埋、切片常规做HE染色，观察肝组织病理学改变；Masson染色用半定量标准判断胶原纤维增生程度。天狼猩红染色后I型、Ⅲ型胶原纤维胶原纤维呈红色，其余组织呈黄色。运用Image-proplus5．0图象分析软件半定量计数肝组织胶原面积，每组随机取5个视野，通过比较各组肝组织的纤维化指数（FI）值评价肝纤维化程度。FI=纤维染色区面积／整个视野面积×100％，最后进行评估。

制定胶原纤维增生程度半定量标准：（一）表示无明显胶原纤维增生；（+）表示胶原纤维增生，中央静脉和门脉区有少量纤维索放射延伸，但无间隔形成；（++）表示胶原纤维明显增生，中央静脉和门脉区纤维索向周围延伸，形成不完全间隔；（+++）表示胶原纤维大量增生，少量菲薄完全间隔（假小叶）形成；（++++）表示完全间隔增厚，假小叶大量形成。

2.2.4统计学处理两小样本均数的比较进行方差分析，计量资料采用t检验，计数资料采用秩和检验。采用SPSSl7.0统计分析软件分析，连续变量经过正态性检验和方差齐性检验后符合正态分布和方差齐的采用f检验，不符台则采用Ma加whitneyu检验和确切概率法计算，P<0.05为差异有统计学意义。

3结果

3.1肝组织学检查实验组小鼠肝脏体积较对照组增大，细胞膜紧张、脆性较对照组大、色泽黄腻；对照组小鼠的肝细胞以中央静脉为中心向周围呈放射状排列，肝细胞呈多面体形，核大而圆，位于细胞中央，无胶原纤维增生。而实验组小鼠正常肝小叶破坏，肝索排列紊乱，肝细胞广泛微泡性脂肪变性，少数细胞嗜酸性变和点状坏死。

讨论

从小鼠的体重数据分析的得出，高脂组小鼠体重一直在上升，而高脂高酒精组的小鼠的体重一开始上升的较快，但是之后速度逐渐减慢，甚至呈下降趋势，可侧面反应小鼠因为高脂与乙醇饮食，又由于CCL4的诱导，使肝的抗氧化物质消耗殆尽，导致肝纤维化严重，肝细胞损伤严重，影响糖脂类蛋白质的代谢，最终导致消瘦。

本实验采用高脂饲料与市售白酒联合建模的方法，13个周后，成功诱导小鼠形成肝纤维化，并且肝纤维化改变明显，高脂组、高脂低酒精组、高脂高酒精组均较对照组有显著性差异，其肝脏HYP含量明显增多。认为其建模方法较单纯的酒精诱导更贴近临床的患者。

参考文献：

[1]ElizabethMB，DinaG，Tiniakos.Pathologyofsteatohepatitis[J].BestPracticeRescliniGastroenterol，2002，16（5）：691-707.

[2]范建高，曾民德.脂肪性肝病[M].北京：人民卫生出版社，2002：18-27.

[3]陈奇.中药药理研究方法学「M」.北京：人民卫生出版社，1994：946一947.

[4]万山洪，付程，李光美.谷胧甘肤改良测定法仁.[J]河南医科大学学报，1991，10（2）：464一465.

[5]戴建国，陈景衡，杨森，等.锅饱和法测定小白鼠肝中金属硫蛋白〔J〕南京医科大学学报，2012，15（3）：722一724.

作者简介：董迪烽（1994—），男，汉族，浙江省杭州市人，2013级本科临床专业在校学生。

通讯作者：姚伟（1989—），女，土家族，湖南省桑植县人，助教，从事眼耳鼻喉教学研究。

基金项目：长沙医学院2015年大学生研究性学习和创新性实验计划项目长医教[2015]15号—83.