唑来膦酸对破骨细胞的分化及骨吸收功能的影响

唑来膦酸对破骨细胞的分化及骨吸收功能的影响

郑振雨朱明明李春娟李静

郑振雨朱明明李春娟李静（新乡医学院第三附属医院脊柱手外科河南新乡453003）

【摘要】目的研究唑来膦酸(ZOL)对兔骨髓单核细胞向破骨细胞分化过程的影响及其对成熟破骨细胞骨吸收功能的影响，探索ZOL治疗骨质疏松的机制。

方法采用唑来膦酸诱导兔骨髓单核细胞形成破骨细胞样细胞以及成熟破骨细胞与骨片共培养的方法，考察唑来膦酸对破骨细胞的形成及骨吸收功能的影响。

结果当浓度为10-6、10-7、10-8mmol/L时，唑来膦酸组骨髓单核细胞形成破骨细胞样细胞的数目明显少于对照组,且骨吸收陷窝数目及表面积亦明显少于对照组。结论唑来膦酸不仅可以明显抑制破骨细胞的分化，同时具有抑制成熟破骨细胞的骨吸收功能的作用。提示唑来膦酸具有改善骨吸收功能亢进的能力。

【关键词】唑来膦酸破骨细胞骨吸收EffectofzoledronateacidonosteoclastogenesisandboneresorptioninvitroZhengzhenyu，Zhumingming，Lichunjuan,lijing.TheThirdAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalCollege，SpineandHandSurgery,Xinxiang453003.【Abstract】ObjectiveTodeterminetheeffectofzoledronateacid(ZOL)onosteoclastogenesisandboneresorptioninvitro.Toinvestigatetheefficacyofpreventiveandtherapeuticeffectofzoledronicacidonosteoporosis.MethodsMatureosteoclatswereisolatedfromlongboneofrabbit.MarrowcellsofrabitwereculturedwiththeinductionofZOL.Osteoclastsfrommarrowcellsanddentinresorptionlacunaewereobservedineachgroups.ResultstherewerelessTrappositivemulti-nucleatedosteoclastsintheZOLtreatmentgroup(concentrationat10-6、10-7、10-8mmol/)thaninthecontrolgroup(P＜0.01).ZOLtreatmentgroupalsoresultedinasignificantdecreaseinresorptionlacunaelevels(P＜0.01).ConclusionZOLsignificantlyinhibitsosteoclastformationandboneresorption，whichmightimprovebonereconstruction.【Keywords】zoledronateosteoclastogenesisboneresorption【中图分类号】R68【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）36-0055-02目前认为，骨质疏松症是一种全身性的代谢性骨骼疾病[1],随着年龄的增加和延长骨密度呈下降趋[2],绝经也和骨质疏松密切相关[3]。二膦酸盐是治疗骨质疏松的重要药物，已经发展到第三代[4]。ZOL是第三代二膦酸盐。ZOL抗骨质吸收的作用是第1代和第2代双膦酸盐的100-850倍[5]，破骨细胞在调节骨重建和骨吸收的过程中起重要作用，因此深入研究ZOL对破骨细胞及其功能的影响，可以为骨质疏松性骨折的治疗提供参考。

1材料与方法1.1材料新生新西兰大耳兔，购自新乡医学院实验室,TRAP染色试剂盒（美国Sigma公司），α-MEM胎牛血清（美国GIBOL公司），1,25-二羟基维生素D3、胰蛋白酶PGE2（Sigma公司）,TDL-40台式离心机（上海安亭科学仪器厂），倒置显微镜(上海长方光学仪器有限公司)，蒸馏机(石家庄同惠环保设备有限公司)，电热恒温干燥箱(上海吴淞五金厂)，电子天平(上海第二天平厂)，培养板(美国Coster)。

1.2骨片的制备[6]：使用电钻将新鲜牛股骨皮质切成200μm厚的薄片，粗、细金刚沙石磨成10μm，6mm×6mm的骨片，清洗3次。

再用α-MEM培养液(1×106U/L青霉素，1g/L链霉素)浸泡，置-4℃冰箱内，用前紫外线照射2面，每面2h。

1.3成熟破骨细胞的分离[7]：将新西兰大白兔断颈处死，在无菌操作，取下四肢长骨，D-Hank平衡盐溶液中剔除附着其上的软组织和骨骺，在α-MEM培养基中，纵向剖开骨干，刮取骨髓直至其颜色变白，然后用培养液彻底冲洗，保留细胞悬液以备用。

1.4骨髓单核细胞的分离[7]将新生新西兰大耳兔断颈处死，无菌操作，取下四肢长骨，D-Hanks平衡盐溶液里剔除软组织和骨骺，以一次性注射器吸取α-MEM全培养液冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞，洗涤后离心，接种于平皿，10小时后，弃掉上清液，缓冲液冲洗，然后将冲洗液加入离心管，用消化液(EDTA)消化5min，离心管离心并弃上清液，然后加入α-MEM培养液，所得细胞吹散后备用。

1.5唑来膦酸对骨髓单核细胞向破骨细胞分化的影响将lα-MEM培养液加入带有载玻片的24孔培养板内，每孔1m，5%CO2，37℃孵育箱中孵育1h,以1.6×109个/L、1ml/孔将骨髓单核细胞悬液接种于无菌24孔板上，置于5%CO2,37℃孵育箱中培养10小时后，加入1,25-(OH)2D3使其终浓度为10-8mmol/L，实验组加入唑来膦酸，使其终浓度分别为10-6、10-7、10-8mmol/L，对照组以加入等量D-Hanks缓冲液和1,25-(OH)2D3，使其终浓度为10-8mmol/L，每隔2天换液,直至d7行TRAP染色检测，按照文献[7]方法，以≥3个细胞核为阳性细胞计数。

1.6唑来膦酸对骨吸收功能的影响分别在24孔培养板内放置处理后的盖玻片和骨磨片,加入1mlα-MEM全培养液，置于37℃5%CO2孵箱内1小时,将备用细胞悬液以1ml/孔分别加入24孔培养板(每孔细胞数约为106个)，37℃5%CO2孵育箱中培养18小时，为检测唑来膦酸对培养体系的作用，本实验分为实验组和对照组,各组均含1,25-(OH)2D3，终浓度为10-8mmol/L，实验组：按唑来膦酸的不同浓度分设10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L共3组，对照组：为D-Hanks缓冲液培养的细胞。倒置相差显微镜观察培养d7的牙本质磨片骨吸收陷窝的数目，在150倍放大倍数下,每例骨片任选5个视野拍照，用医学数码图像分析系统(StatView4.02软件)测量各视野吸收陷窝数目及陷窝面积。

1.7统计学处理实验数据数据表示为x-±s，应用SPSS13.0统计软件对数据进行检验，各组总体上有无差别采用单因素方差分析，组间比较采用LSD法分析，p<0.05为有统计学意义。

2结果2.1细胞形态学观察成熟破骨细胞的证实采用TRAP染色，染成红色的为破骨细胞，经过培养后2h，细胞的形态开始变的清晰，呈现出煎蛋形、漏斗形或不规则形状，并且有片状和丝状伪足，细胞核≥3个，胞核内有空泡形成,见图1。

图1:

2.2ZOL对OC生成的影响骨髓单核细胞培养d3，可见培养皿中有少量破骨样细胞，d7出现大量多核破骨样细胞，各组细胞数统计均符合正态分布，实验组与对照组均可见TRAP染色阳性的破骨细胞，但实验组阳性细胞数量少于对照组(P＜0.01)，实验组破骨细胞的体积较小，且实验组间比较ZOL浓度越高细胞数越少(P＜0.01)，表明ZOL可抑制培养体系中破骨细胞生成,见表1。

表1：7天后不同实验组TRAP阳性细胞数

注：*与对照组比较P＜0.01●组间比较P＜0.012.3ZOL对OC骨吸收功能吸收陷窝计数及陷窝面积的影响破骨细胞在骨片培养24h后，骨片上出现少量吸收陷窝，至d3陷窝开始明显数量增多，至d7出现连片的吸收陷窝，破骨细胞在牙本质磨片上的吸收陷窝为不规则形，大小不一，对照组吸收陷窝面积较大，陷窝数目较多，各组数据均符合正太分布，实验组吸收陷窝面积较小，数目较少(P＜0.01)，说明ZOL在培养体系中可显著抑制OC骨吸收功能，且浓度为10-6、10-7、10-8mmol/L的唑来膦酸呈剂量依赖性的抑制陷窝数目的增加(P＜0.01),见表2。

表2：7天后骨吸收陷窝计数及面积数值

注：*与对照组比较P＜0.01*●组间比较P＜0.013讨论双膦酸盐类是近年来发展起来的一类调节骨代谢的新药，对老年性和绝经后骨质疏松的治疗作用明显，BP可以干扰OC的多个生化过程[8],ZOL由瑞士Novartis公司开发，可以预防骨质疏松症等疾病[9]。有研究显示ZOL可抑制OC生成，可能与其对Syk基因表达的抑制有关[10]。已经有动物实验在15分钟内单次注射5mgZOL，效果可以与其他双膦酸盐十二个月的治疗效果相当[11]。最近的研究显示唑来膦酸能加快骨痂形成，促进成骨细胞TGF-β的表达[12]。ZOL促进成骨细胞分泌OPG，该物质可以封闭RANKL和RANK的结合，从而抑制OC的活性[13]。我们的实验结果显示唑来膦酸对骨髓细胞分化成破骨细胞的过程中，培养第7天可见散在分布的形态不规则的多核细胞，经TRAP染色显示这些多核细胞为阳性破骨细胞。含有唑来膦酸的实验组中，细胞始终以单核细胞为主，没有发现TRAP染色阳性的破骨细胞。该试验还显示ZOL抑制骨吸收，并能吸收陷窝数目及面积减少。这些都说明ZOL不仅可以抑制成熟的破骨细胞的活性，而且可以减少骨髓细胞向破骨细胞的分化，进而减少破骨细胞的产生。因此，本研究结果说明ZOL具有增加骨形成的作用，为临床治疗提供了依据。

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