白花前胡丙素对人肺癌A549细胞B7H3表达的调节作用

白花前胡丙素对人肺癌A549细胞B7H3表达的调节作用

陈清阁王雄彪(通讯作者)

（上海中医药大学附属普陀医院呼吸科上海200062）

【摘要】目的：研究白花前胡丙素（Pra-c）对人肺癌A549细胞B7H3表达的调节作用。方法：将人肺癌细胞A549分别用不同浓度Pra-C、50ng/mlIFN-γ及不加药培养基（空白组）处理，用流式细胞学技术检测其B7H3蛋白表达水平，用RT-PCR技术检测B7H3转录水平；构建B7H3荧光报告基因，以不同浓度Pra-C、50ng/mlIFN-γ及不加药培养基（空白组）处理，以双荧光素酶法观察其对B7H3启动子区的作用。结果：Pra-C浓度在10μmol/ml～40μmol/ml时，下调B7H3蛋白表达且具剂量依赖性（P<0.05），40μmol/mlPra-C对B7H3蛋白的下调用最强，与50ng/mlIFN-γ组无统计学差异（P＞0.05）；40μmol/mlPra-C可显著下调A549细胞B7H3mRNA转录水平(P<0.05)，且与50ng/mlIFN-γ组无统计学差异（P＞0.05）；40μmol/mlPra-C处理B7H3荧光报告基因可显著下调B7H3启动子相对荧光强度（P<0.001），且与50ng/mlIFN-γ组无统计学差异（P＞0.05）。结论：40μmol/mlPra-C能通过下调B7H3启动子区转录，从而下调A549细胞mRNA转录进而抑制性共刺激分子B7H3蛋白。

【关键词】白花前胡丙素；B7H3；肺癌

【中图分类号】R734.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2018）04-0123-01

B7H3作为重要的抑制性共刺激分子，其高表达抑制了T细胞对肿瘤细胞的免疫活性，造成肿瘤细胞的免疫逃逸。B7H3的高表达与淋巴结转移、TNM分期明显相关，是一个重要的肺癌治疗靶点。Pra-C是中药前胡中重要提取物之一，本实验通过检测Pra-C对人肺癌A549细胞B7H3表达、基因水平的调节，探讨Pra-C对共刺激分子B7H3的调节作用。

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞来源及培养人肺癌细胞A549由上海中国科学研究院细胞库提供，常规培养于双抗和10%小牛血清的RPMI1640培养液中，在37℃、5%CO2的条件下培养。

1.1.2实验试剂与仪器RPMI-1640培养基（Gibco）；Pra-C（成都曼彻斯特）；双荧光素酶检测试剂盒（Promega）；B7H3引物与探针（闪晶），ABI7300全自动荧光定量PCR仪（美国ABI公司）等。

1.2方法

1.2.1流式细胞术A549细胞以5×104个/孔接种于24孔板，加药48h后分别收集于流式细胞管中，清洗后调整每管体积为50μL；加入B7H3-PE抗体5μL，4℃避光30min；加300μLD-Hanks缓冲液，上机。

1.2.2Real-TimePCR反应条件：94℃10min，94℃30s，60℃1min，40个循环，以GAPDH基因作为内参，引物序列如下：B3H3-F5’-GTGGTGCTGGGTGCAAT-3’；B3H3-R5’-CCTCTGGGGGGAATGTCATA-3’；B3H3-probe5’-GTGGTGCTGGGTGCAAT-3’；GAPDH-F5’-CCACTCCTCCACCTTTGAC-3’；GAPDH–R5’-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3’；GAPDH-probe5’-TTGCCCTCAACGACCACTTTGTC-3’

1.2.3B7H3-PGL3报告基因的构建设计人B7H3启动子引物，B7H3-F5’-gcGGTACCCGGTTCCTCCCTTCATAGC-3’；B7H3-RCCTGAGTCCCAGAGTCG；扩增产物长度为1240bp，转化感受态细胞，筛选克隆，测序结果正确后样本质粒提取。

1.2.4荧光素酶实验将B7H3-PGL3质粒转染至A549细胞中，分为Pra-C40μmol/ml组、IFN-γ组、空白对照组，24小时后，GloMax20/20发光检测仪检测相对荧光强度。

1.3统计学方法

应用SPSS21.0统计软件，本实验数据为计量资料，实验数据以x-±s表示，采用SNK-q检验比较多组间差异，计量资料采用两独立样本t检验比较两组间差异，以P<0.05为有统计学意义。

2.结果

2.1Pra-C可以下调A549细胞B7H3蛋白的表达

SNK-q检验不同处理组间A549细胞B7H3蛋白的表达差异，发现Pra-C浓度在40μmol/ml、20μmol/ml、10μmol/ml时B7H3蛋白的相对表达量分别为（0.235±0.01）（0.38±0.009）（0.43±0.004），其下调作用具有剂量依赖性，Pra-C浓度在40μmol/ml时与50ng/mlIFN-γ对A549细胞B7H3蛋白的下调作用无显著差异（P=0.054）。

2.2Pra-C可以下调A549细胞B7H3mRNA的表达

Real-TimePCR结果显示，40μmol/mlPra-C组及50ng/mlIFN-γ组作用于A549细胞24h后均可显著下调A549细胞B7H3mRNA转录水平(分别是0.712±0.17，0.726±0.15，P=0.017,P=0.005)，且两组之间无显著差异，（t=-0.115，P=0.913）

2.3Pra-C对B7H3-PGL3-promoter荧光报告基因的调节

荧光素酶实验结果显示不同处理组B7H3相对荧光强度：40μmol/ml与IFN-γ组均可显著下调A549细胞B7H3启动子转录（分别是0.236±0.15，0.257±0.002，P<0.001），且Pra-C与INF-γ对B7H3的调节作用无显著差异（t=-2.628，P=0.054）。

3.讨论

肺癌是当今全世界发生率和死亡率最高的恶性肿瘤。由APC细胞表面的多种共刺激分子与T细胞表面的相应受体结合，可以决定接受抗原刺激的T细胞是活化增殖，还是抑制甚至凋亡。B7H3作为重要的抑制性共刺激分子，其高表达抑制了T细胞对肿瘤细胞的免疫活性，造成肿瘤细胞的免疫逃逸，可成为肺癌治疗的靶点。

已有研究显示，50ng/mlIFN-γ可下调人肺癌细胞A549表面B7H3的表达。本研究用流式细胞学技术、RT-PCR技术、双荧光素酶法分别检测B7H3蛋白表达水平、转录水平及启动子区的调节水平。结果显示，当Pra-C浓度为40μmol/ml时下调作用最强，较50ng/mlIFN-γ无统计学差异。

Pra-C是前胡重要的香豆素类化合物提取物之一。前胡作为呼吸疾病常用药物，具有降气化痰、疏散风热之功，探讨Pra-C通过免疫调节作用发挥抗肿瘤疗效对拓展中草药前胡在抗肿瘤领域的思路有一定价值。

【参考文献】

[1]刘一诚，戴彭辰，李慧英，腾柱国，何成诗.共刺激因子B7H3在非小细胞肺癌中的表达研究.现代生物医学进展，2016,16(27):5309-531.

[2]赵建强，孙玉萍，王薇，等.B7H3分子在非小细胞肺癌中表达的研究.中国全科医学，2008,11(1A):31-34.

上海市普陀区高层次人才科研创新项目（编号2014-A-23）资助