五种国内常用流感疫苗的分析比较

五种国内常用流感疫苗的分析比较

庄文佳丛莉蔡兴雁陈小平

庄文佳丛莉蔡兴雁陈小平（通讯作者）（同济大学医学院基础医学部免疫教研室200092）

【中图分类号】R186【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）27-0071-04

【摘要】本课题主要对2009-2010年度的针对流感病毒的四个病毒颗粒裂解疫苗（福禄立适?、华兰生物生产的流感病毒裂解疫苗、安尔来福、凡尔灵）和一个只含病毒表面糖蛋白的亚单位疫苗（爱阁力保?）进行了与免疫保护相关的有效分子的测定，同时对疫苗制备过程中可能对机体产生具有副作用的分子也加以分析。结果显示各疫苗均能检测到神经氨酸酶活性和血凝素蛋白的红细胞凝集活性，其中安尔来福的神经氨酸酶活性高出其他产品10倍，福禄立适?则显示出最佳的红细胞凝集活性;基质蛋白仅在华兰生物生产的流感病毒裂解疫苗及安尔来福这两个裂解病毒颗粒疫苗中明显被检测到。另外，各疫苗中鸡卵清蛋白含量都很低，但安尔来福的含量明显高于其他疫苗，本研究结果可对疫苗选择提供参考。

流感是由流感病毒(influenzavirus)引起的一种以侵害呼吸系统为主的疾病，在世界各国广泛流行，每年在世界范围内造成25至50万人死亡[1]，是危害人类健康的重要传染病之一。近些年来，我国的生态环境严重破坏，人流感的发生和发展规律发生了较大变化。发病频率的上升，造成了严重的社会影响和重大的经济损失。给予高危险人群适当时间接种流感疫苗仍然是预防流感的最佳方法。

流感病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，是一种含有8个不同基因片段的分节段RNA病毒。由于该病毒的复制所需的是以RNA为模板的RNA多聚酶，不具纠错功能（与DNA多聚酶不同），因此流感病毒极易发生抗原突变也叫抗原漂移（antigendrift），使得机体难以累积免疫保护力[2]。此外在A型流感病毒中，除水禽是它的天然宿主，它偶然可交叉感染人或其他哺乳动物。在这种不同种动物交叉感染过程中，病毒遗传物质易发生较大变异，导致抗原转变（antigenshift），形成新血清亚型株。由于抗原转移和抗原漂移，都使得准确预测当年流感病毒株几乎不可能，给每年流感的防控带来巨大困难[3]。目前常用方法是由世界卫生组织根据历史数据预测可能的流行株而生产流感疫苗，通常的流感疫苗除含有两种A血清亚型株外，还含有一种B型流感株，所谓三价疫苗[4]。

与流感病毒侵袭力及免疫保护力相关的流感病毒的抗原主要有血凝素蛋白(haemagglutinin，HA）神经氨酸酶(Neuraminidase，NA）核蛋白(NuclearProtein，NP)和基质蛋白M(Matrix)等分子[5]。针对HA的抗体能够中和病毒，抵御感染。对NA抗原的研究发现，含NA基因的DNA疫苗或类病毒样颗粒（VLP）疫苗均能激发机体的抗体反应，并有不同程度的保护作用[6，7]。不幸的是，HA和NA同时也是最容易发生变异的分子，给流感的防控带来了难题[8]。

疫苗接种对流感从预防角度发挥着重要的作用。流感疫苗经过五十多年的发展，主要有裂解灭活全病毒疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗和DNA疫苗。传统的减毒活疫苗可以诱导细胞免疫和体液免疫，是目前市场上使用最广泛的疫苗[9]，但它也可能仍保留一定残余毒力，存在潜在的“返祖”现象[8，10]。无论何种形式疫苗，都面临着一个巨大挑战，即流感病毒的抗原变异性大，使得疫苗生产每年都需要更换病毒株。

本课题旨在对2009-2010年度几种国内常用流感疫苗中，有效分子含量及有可能引起副作用无效分子污染情况的分析比较，为相关机构及个体选择流感疫苗时做参考。

材料与方法

疫苗样本：

本课题的研究对象为2009-2010年度的商品化疫苗，其中四种三价裂解流感病毒疫苗分别为福禄立适?（英国葛兰素史克公司，批号XFLUA499B1）凡尔灵（法国赛诺非巴斯德公司，批号20090804），流感病毒裂解疫苗（华兰生物工程股份有限公司，批号200906A11）安尔来福（北京科兴生物制品有限公司，批号20090735），及针对HA的亚单位流感病毒疫苗爱阁力保?（瑞士诺华公司，批号095004）。

蛋白定量：

以BCA法测定各样品蛋白含量。

SDS-PAGE凝胶电泳及凝胶扫描：

蛋白用SDS-PAGE凝胶电泳后条带分开，利用LI-COR公司的Odyssey成像系统进行扫描，并通过灰度值计算各蛋白在总蛋白中所占的百分比。

免疫印迹（westernblot）:

SDS-PAGE相同条件进电泳后，将蛋白转膜，室温下封闭1小时，随后孵育一抗，将抗流感病毒血清按1：200稀释，4℃孵育过夜。二抗为IRDye800CWDonkeyanti-GoatIgG(H+L)（LI-COR），1：10000稀释，避光孵育30分钟后，使用Odyssey成像系统进行扫描。

卵清蛋白（OVA）含量：

利用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定各疫苗中卵清白蛋白含量（OVA）。酶标板以小鼠抗OVA血清4℃包被过夜，随后加入卵清蛋白标准品及疫苗检测样品，室温放置1小时，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡卵清蛋白抗体（北京博奥森），37℃，1小时，将30%的过氧化氢与2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)（ABTS）溶液1：1000稀释作为底物，室温避光30分钟后，450nm检测吸光度，并计算标准曲线与样品浓度。

血凝试验：

所有疫苗以1：100为起始稀释浓度用生理盐水进行对倍稀释，随后加入10μl的1%鸡红细胞，振荡摇匀，室温孵育30分钟，观察鸡红细胞的凝集。

神经氨酸酶含量：

微量反应板每孔加入150μl的50μg/ml人胎球蛋白，4℃包被过夜，将稀释好的标准品（弧菌霍乱，1U/ml，）与样品加入反应板中，37℃放置1小时，加入1/1000稀释的过氧化物酶标记花生凝集素溶液，37℃放置1小时，将30%的过氧化氢与ABTS溶液1：1000稀释作为底物，室温避光30分钟后，450nm检测吸光度，并计算标准曲线与样品浓度。

内毒素含量

内毒素检测选用厦门市鲎试剂实验厂有限公司生产的动态显色法鲎试剂盒检测。

结果

1.HA、NP/NA和M分子含量的测定与比较

首先采用非变性SDS－PAGE和考马斯亮蓝染色法，检测及比较各个常见的流感疫苗中所含有效分子的含量。如图1所示，每种疫苗样本的6μg蛋白，经电泳分离及染色后，亚单位疫苗爱阁力保?只有HA（包括多聚体和单体）被检测到，证实了该疫苗确为亚单位疫苗。同时其他四家公司的裂解疫苗可检测出HA多聚体及单体，核蛋白（NP）和神经氨酸酶(NA)。后两者由于分子量均约为60KD，在凝胶上近似为一条带，无有效方法将两种蛋白分开。无论何种疫苗，未检测出明显M蛋白。此外，在所有的样品中，都有其他条带出现，提示所有疫苗均含有所谓“杂质”成分或降解成分。

由于中国药典委对疫苗内总蛋白含量及HA的含量等，均有明确规定，通过Odyssey对蛋白凝胶（图1）进行扫描以获得HA单体、NA和NP的相对量，再结合总蛋白含量，得到各个疫苗样本中所含的不同病毒组分的绝对含量（μg）及样本中所含的疫苗有效蛋白的比例。如表1和图2所示，亚单位疫苗爱阁力保?的总蛋白含量最低，每0.5ml针剂含量为83.1μg，其中HA单体的比例约为43.4%，含量为36.1μg。总蛋白量最高的是华兰生产的流感病毒裂解疫苗及福禄立适?，但福禄立适?所含特异性疫苗有效蛋白百分比为77.4%（132.1μg）高于华兰产品，也是5种疫苗中最高的。结果还显示，每0.5ml针剂HA的含量在34.2～91.1μg之间，均符合国家药典规定含量，但各疫苗之间有明显差异，福禄立适?含量最高，为91.1μg。

为了明确这些疫苗所含的分子含有正确的免疫反应性，我们利用WHO提供的标准抗血清，通过免疫印迹法验证。如图3所示，所有样品中的HA多聚体和单体，都和标准抗血清有强结合，说明这些产品的所含的HA抗原具有其应有的半抗原性。但是针对NA/NP的结合则远远低于HA的结合，即使在蛋白电泳中显示出高水平的华兰的产品（图1），也未能显示出更强的条带。最后，通过此方法，华兰生产的流感病毒裂解疫苗及安尔来福被检测到微量的M蛋白，另外二种裂解疫苗均未检测到。

2.HA及NA的活性的测定与比较

鉴于HA和NA均是具有活性的蛋白，因此他们的活性是否存在，反映疫苗生产及保存的好坏。5种疫苗中均有检测出NA的酶活性。所得酶活性经NA含量纠正后(用表1中NA/NP量纠正)，比较单位酶活性发现，以安尔来福最高，最低的是华兰生产的流感疫苗（表2）。同样所有疫苗样本均可促鸡红细胞凝集，其中凡尔灵及安尔来福反应滴度最低为1：800，最高的为福禄立适?，高于所检测的上限1：12800（图4），与其较高的HA含量正相关。相反华兰生物及安尔来福的流感病毒裂解疫苗，尽管其HA含量略低于福禄立适?所含的HA（表1），但其生物学活性则不成比例的低于福禄立适?所含的生物学活性。

3.OVA及内毒素分子含量的测定与比较

用ELISA法检测各种疫苗样本发现，它们所携带的卵清白蛋白浓度大不相同。其中安尔来福中卵清蛋白含量最高，每0.5ml针剂含69.10ng，其次为华兰生产的流感病毒裂解疫苗，每0.5ml针剂含有60.58ng。而含量最低的是福禄立适?，每0.5ml针剂仅含8.13ng（表3）。

内毒素含量最高的疫苗是华兰生产的流感病毒裂解疫苗，每0.5ml针剂为0.08EU，相对的，福禄立适?及凡尔灵两种疫苗的内毒素含量均低于检测的最低限而未测出（表3）。

讨论

根据国家药典委2008年9月“第九届药典委员会病毒类制品专业委员会第三次会议纪要”及2007年1月“流感病毒裂解疫苗”国家标准修订稿意见，病毒裂解疫苗的总蛋白质含量应不高于200μg/0.5ml针剂；并不得超过疫苗中血凝素总含量的6倍，HA含量应不低于12μg（每株）/0.5ml针剂，OVA含量应不高于250ng/0.5ml针剂，细菌内毒素含量应小于10EU/0.5ml针剂。而对于亚单位流感疫苗国内制备条件尚未成熟，并没有相关标准，因此参考欧洲药典标准，亚单位疫苗中每株病毒蛋白含量为80μg/0.5ml针剂，总蛋白不超过240μg/0.5ml针剂，并且每病毒株血凝素不超过40μg/0.5ml针剂，而总的HA含量不超过120μg/0.5ml针剂。

根据以上标准，所检测的流感病毒裂解疫苗，都基本符合国家标准，但其中有效成分相对含量在各个产品中不尽相同。如福禄立适?含病毒来源的与疫苗保护作用相关的有效蛋白百分比与净含量是最高的，分别为77.4%和132.1μg。虽然华兰的有效蛋白百分比较高为58.1%，但是由于其总蛋白含量很高，因此病毒来源的非有效蛋白及其他生产过程中的非病毒蛋白如OVA的净含量为检测样本中最高的，为71.5μg/0.5ml针剂。病毒来源的非有效蛋白及其他生产过程中的非病毒蛋白如OVA的净含量最低是的安尔来福，仅30.4μg/0.5ml，而且，其有效蛋白的百分比为69.9%仅次于福禄立适?，然而，由于总蛋白含量较低，相应的其有效蛋白的净含量却很低，仅为70.8μg/0.5ml，是裂解疫苗中净含量最低的。

虽然NA的酶活性及HA的生物学活性并未列入国家标准，但是考虑到其可做为考察产品的生产和保存情况，同时有报道认为这些活性直接影响免疫原性#，所以本课题中依旧对其进行了检测。结果可见，NA活性最强以安尔来福的最强，华兰的最弱；而福禄立适?的HA活性最佳，安尔来福的HA活性最弱。

另一方面，针对常见的过敏原OVA的检测提示，各疫苗均未高出国家标准。虽然如此，在含量上各疫苗还是有很大差别，其中含量最低的是福禄立适?，最高的是安尔来福，也就是说，在极端个别的情况下，福禄立适?最不易引发过敏反应，爱阁力保?次之，而安尔来福最容易引发（表2）[11]。内毒素污染均低于国家标准，标准以下又以华兰生产的流感病毒裂解疫苗（0.08EU/0.5ml针剂）最高，而福禄立适?及凡尔灵两种疫苗的内毒素含量均因低于检测的最低限而未测出。

总之，本课题针对疫苗的分子和生化指标进行分析，发现不同来源的疫苗所含有的有效成分含量及活性差别大，并且含有的可能引起副作用的成分差别也大。疫苗的选择是个复杂的课题，有效抗原的含量及活性当然应是首选指标，可能引起副作用的成分也不能忽视。

参考文献

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图1.非变性SDS-PAGE电泳检测五种疫苗。每个样本总蛋白量为6μg。分别以80V和150V进行浓缩胶和分离胶的电泳，以考马斯亮蓝染色后用Odyssey进行扫描。凝胶可见单体HA（80kDa）多聚体HA（225kDa），NP和NA（60kDa）。M应为30kDa。

图2.各疫苗总蛋白含量及病毒特异性蛋白所占总蛋白的百分比

表1不同疫苗样本中总蛋白量及有效蛋白组分在疫苗中的含量

图3.免疫印迹检测病毒特异性蛋白。SDS–PAGE电泳后将进行转膜，一抗为三种特异性抗血清混合（H1N1，A/Brisbane/59/2007IVR-148antiserum08/112；H3N2，A/Brisbane/10/2007-likeantiserum08/246；B，B/Brisbane/60/2008likeantiserum08/354），二抗为红外标记的抗羊抗体。

表2.不同疫苗样本中NA酶活性（每0.5ml针剂含量）

图4各流感疫苗的血凝特性的比较分析(每0.5ml针剂含量)

表3.五种疫苗中OVA及内毒素含量（每0.5ml针剂含量）