肾虚血瘀型卵巢早衰模型大鼠的建立

肾虚血瘀型卵巢早衰模型大鼠的建立

黄叶芳1李宛静2邓蒂斯2张纯2

（1成都中医药大学附属医院四川成都610000）（2成都中医药大学四川成都610000）

【摘要】目的：建立并优化肾虚血瘀型卵巢早衰动物模型，为中医药辨证治疗肾虚血瘀型卵巢早衰提供实验研究基础。方法：将动情周期正常的48只大鼠随机分为空白组、疾病模型组、病症结合模型组A（雷公藤多苷片+冰浴法）、病症结合模型组B（雷公藤多苷片+猫吓鼠+高脂饮食），每组12只，按照实验方案实施，每组大鼠连续造模28天后24h取材，采用放射免疫分析法测定血中雌二醇（E2）含量，ELISA法测定抗缪勒管激素（AMH），及测定血液流变学相关指标。结果：与空白组相比，疾病模型组、病证结合模型组A和、B的E2和AMH水平下降（P＜0.05）；病证结合模型组A和B组与空白组及疾病模型组相比，血液粘度、全血低切还原粘度及全血高切还原粘度均上升（P＜0.05），提示血液处于高凝状态，其中病证结合模型组B组在血浆粘度改变上较A组升高明显（P＜0.05）。结论：雷公藤多苷片悬浮液灌胃结合“冰浴法”，或“猫吓鼠”加高脂饮食造模28天可成功建立肾虚血瘀型卵巢早衰大鼠模型；“猫吓鼠”加高脂饮食法在血浆粘度改变上优于“冰浴法”。

【关键词】肾虚血瘀；动物模型；卵巢早衰；大鼠

【中图分类号】R965【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2018）24-0362-03

卵巢早衰（prematureovarianfailure，POF）是指妇女40岁前出现原发或继发性闭经，表现为高水平的促性腺激素（卵泡刺激素、黄体生成素）和低水平的雌激素，患者长期的低雌激素水平增加不孕、骨质疏松症、冠心病和抑郁症的风险，并可能导致神经系统疾病和认知功能受损[1]。卵巢早衰在临床上治疗难度大，并且其发病率呈逐年上升的趋势[2]。祖国医学中并无“卵巢早衰”的病名，而是根据其不同的临床表现可归纳为中医学中的“月经先期”“月经后期”“月经先后不定期”“月经过少”“崩漏”“全不产”“断续”“绝经前后诸证”等。目前文献报道中所构建的卵巢早衰模型仅仅是疾病模型，未能结合证型，对中医药研究上仍是有所缺陷。故本研究建立肾虚血瘀型POF动物模型，为中医药辨证治疗肾虚血瘀型卵巢早衰提供研究基础[3]。

1.材料与方法

1.1实验动物

SD雌性大鼠，SPF级，10-12周龄，健康，四川省中医药科学院提供，动物许可证SYXK(川)2013-100，隔日换垫料，自由饮食饮水，均喂养标准大鼠颗粒饲料，室温控制在22～25℃，湿度70%，通风良好。入组标准：动物购入后适应性喂养2～3天，连续5～10天做阴道涂片，动情周期正常的大鼠纳入。

1.2仪器与试剂

放免计数分析仪GC1200（科大创新股份有限公司中佳分公司）；酶标分析仪KC-100（深圳市凯特生物医疗电子科技有限公司）；自动血流变测试仪SA-9000（北京赛科希德科技发展有限公司）。雌二醇（E2）放射免疫分析药盒（天津九鼎医学生物工程有限公司）；大鼠抗缪勒管激素（AMH）ELISA试剂盒（BIOVALUE公司）；雷公藤多甙片（10mg/片，湖南协力药业有限公司生产）。

1.3模型的建立与分组

将有动情周期的48只大鼠随机分为空白组、疾病模型组和病症结合模型组A、病症结合模型组B，每组12只。

（1）空白组：灌服生理盐水2ml/100g，1次/d，标准大鼠颗粒饲料喂养，共28天。

（2）疾病模型组：生理盐水配制的雷公藤多甙片悬浮液灌胃，50mg?（kg?d）-1，标准大鼠颗粒饲料喂养，共28天。

（3）病证结合模型组A：给药方法同疾病模型组，同时对大鼠施加冰浴，连续28日。冰浴方法如下：每天将大鼠放置于0至1摄氏度冰水中浸泡（浸泡部位至腹部即可），浸泡时间为20分钟/天，连续进行28天。

（4）病证结合模型组B：生理盐水配制的雷公藤多甙片悬浮液灌胃，50mg?kg-1?d-1，同时对大鼠施加惊恐和高脂饮食，连续28日。施加惊恐和高脂饮食方法如下：（1）惊恐：采用猫吓鼠法(即恐伤肾)建立肾虚模型，将该组大鼠放入特制的小铁丝笼内，此小笼固定在装有一只大公猫的大笼中，猫可在内自由活动，该猫凶狠善捕鼠。猫与鼠仅一网之隔，猫爪可以触及鼠。每天上、下午各恐吓2h，即9:00～11:00，15:00～17:00，期间每隔20min刺激猫一次，使其发出叫声。（2）高脂高糖饮食：高脂高糖饲料40克（配方为：猪油15%、白糖8%、胆酸钠1%、胆固醇5%、丙基硫氧嘧啶0.2%、基础饲料71.8%）喂养大鼠。

1.4标本处理及血清性激素的测定

每组大鼠于造模结束后24h分别取材，麻醉后股动脉取血，处死，留取子宫和卵巢标本用滤纸吸干后，称其湿重，在AAF固定液中固定48h，做病理切片。

1.5观察指标

1.5.1一般观察在随机分组后，观察各组大鼠给药前被毛、皮肤、粪便、肌肉张力、步态、精神、呼吸和进食、舌体、唇周颜色等情况，给药结束后再次观察上述指标，进行对比分析。

1.5.2造模后大鼠血清E2、AMH水平的测定：每组大鼠于造模结束后24h分别取材，麻醉后股动脉取血，置于EP管内离心后检测（另留取3ml用于血流变指标测定），采用放射免疫分析法测定血中雌二醇（E2）含量，ELISA法测定抗缪勒管激素（AMH），操作规程按试剂盒说明书进行。

1.5.3血液流变学指标检测取血后留取3ml至肝素钠抗凝管内，检测全血黏度、血浆黏度、红细胞压积、红细胞聚集指数、纤维蛋白原、红细胞变形指数等指标。

1.6统计学方法

实验数据采用IBMSPSS21.0统计软件进行分析处理。计量资料采用均数±标准差（x-±s）进行描述。数据采用单因素方差分析进行比较，P＜0.05有统计学意义。

2.结果

2.1一般情况观察

空白组大鼠一般状态良好，毛色光滑，反应灵活，大便成形，纳食正常，大便正常，舌质红润。与空白组比较，疾病模型组大鼠出现被毛稍粗糙，毛色无华，蜷缩少动，反应较为迟钝，纳食减少，大便偏稀，舌质偏暗等，病症结合模型A、B组除出现疾病模型组表现外，还兼见尾部自尖至根出现不同程度瘀青，部分便溏，舌质瘀紫等。

2.2造模后四组大鼠血清E2和AMH水平的变化（见表1）。

疾病模型组、病证结合模型组A和B组与空白组相比，均出现E2和AMH水平下降（P＜0.05），有统计学意义。该三组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

3.讨论

本研究结果显示，两种方案制备的大鼠模型，激素测定显示E2、AMH下降，符合卵巢早衰变化，同时具备肾虚血瘀的中医体征，血液流变学中血液粘度、全血低切还原粘度及全血高切还原粘度均上升（P＜0.05），提示血液处于高凝状态，其中B组在血液粘度改变上优于A组（P＜0.05）。综上所述，雷公藤多苷片悬浮液灌胃，50mg?（kg?d）-1结合“冰浴法”，或“猫吓鼠”加高脂饮食造模28天，可成功建立肾虚血瘀型卵巢早衰大鼠模型；“猫吓鼠”加高脂饮食法在血浆粘度改变上优于“冰浴法”。

【参考文献】

[1]JanseF,WithLMD,DuranKJ.LimitedcontributionofNR5A1,(SF-1)mutationsinwomenwithprimaryovarianinsufficiency(POI)[J].Fertility&Sterility,2012,97(1):141-146.e2.

[2]王冰，王旭东.中医药对不同卵巢早衰模型治疗的研究进展[J].医学综述，2016，22(6).

[3]郜洁，谢蓝，巫海旺，等.中医妇科病证结合动物模型研究思路[J].中医杂志，2016，57(4):299-301.

课题来源：成都中医药大学科技发展基金《肾虚血瘀型卵巢早衰病证结合动物模型研究》项目编号：ZRQN1629，负责人：黄叶芳