ELISA检测梅毒螺旋体抗体影响因素探讨

ELISA检测梅毒螺旋体抗体影响因素探讨

李秋鸣舒永霞

李秋鸣舒永霞（张掖市中心血站甘肃张掖734000）

【关键词】ELISA梅毒螺旋体抗体标本

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）22-0074-02

ELISA检测梅毒螺旋体抗体是1种敏感性高、特异性强、重复性好的实验诊断方法，但在实际操作中的影响因素较多，本站自2009年采用ELISA法检测梅毒螺旋体抗体以来，对试验的影响因素进行了分析，现就比较常见的影响因素作一些探讨。

1标本的影响因素

1.1外源性因素包括标本溶血、标本被细菌污染、标本保存时间过长、标本凝固不全和乳糜血等。标本溶血对ELISA的影响主要是反应孔对溶血血清中的血红蛋白的非特异性吸附和溶血时细胞内液对血清的稀释作用。Hb具有类过氧化酶活性，其作用与辣根过氧化物酶类似，如果反应孔非特异吸附：Hb而残留，则可催化底物显色，使本底吸光度值升高甚至造成假阳性。当标本中抗体浓度与吸光度值呈线性关系时才会因溶血的稀释作用使吸光度值下降；当标本中抗体浓度近临界值时，可能造成假阴性。标本的污染菌体可能含有内源性辣根过氧化物酶，可使试验出现非特异性显色，使结果出现假阳性。标本在冰箱中保存过久，血清中IgG可聚合成多聚体，AFP可形成二聚体，在用间接法测定中会导致本底过深，甚至造成假阳性。冰冻保存的标本反复冻融产生机械剪切力对标本中的蛋白等分子有破坏作用，可引起假阴性结果。标本凝固不全的血清中含有部分纤维蛋白原，如将其加入微孔中，在ELISA测定过程中仍可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易使结果呈假阳性。乳糜血中的乳糜微粒会吸附于反应孔壁，可能造成非特异吸附，致使结果出现假阳性。

1.2内源性因素包括类风湿因子、补体、高浓度的非特异免疫球蛋白、异嗜性抗体、某些自身抗体等。在类风湿患者及正常人血清中，常含有较高或不同浓度的类风湿因子(RF)，其一般为IgM型，亦有IgG和IgA型，具有与变性IgG产生非特异结合的特点，因为在ELISA测定中，其可与固相上包被的特异抗体IgG以及随后加入的酶标的特异抗体IgG结合，从而出现假阳性结果。补体在固相酶免疫测定中，来自哺乳动物的固相抗体和酶标二抗均有激活人补体系统的功能。一方面，固相抗体和酶标二抗可因其吸附及结合过程中抗体分子发生变构，使Fc段的补体clq结合点暴露出来，使clq成为1个中介物将二者交联起来出现假阳性结果。另一方面，固相抗体也会因为活化补体的结合，封闭抗体和抗原的表位结合能力而引起假阴性。人类血清中含有抗啮齿类动物的免疫球蛋白(Ig)的抗体，即天然的异嗜性抗体，异嗜性抗体可通过交联固相和酶标的单抗或多抗而出现假阳性反应。

2试剂的影响因素

2.1试剂的选择目前ELISA检测梅毒螺旋体抗体试剂盒均采用基因工程方法，TP47和TmpA等包被酶联板，由于不同厂家TP抗原组合不同，来源和用量方面也有差异，造成不同厂家的ELISA检测梅毒螺旋体抗体试剂盒检测结果有很大差异，虽然国家采用批批检定的形式对ELISA试剂严格把关，但不同厂家的试剂在使用效果上仍存在差异。要选择灵敏度高、特异性强的试剂。

2.2试剂的运输、贮存要在低温(2～8℃)条件下进行。因酶类物质是1种特殊的蛋白质，久置、反复冻融或受热后，酶易失去活性，反应微孔板条如果一次用不完时，应进行密封保存防止受潮，并在短期内使用。

2.3试剂的准备在临床实验室，对试剂的准备一般不太注意，通常的做法是在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽略了这种做法有可能影响后面时间不够的问题，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此，在ELISA测定前试剂的准备也是很重要的，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20～30min后(或根据本实验的实际情况确定平衡时间)，再进行测定，使试剂盒在使用前与室温平衡，这样做的目的能使反应微孔内的温度较快地达到所需的温度，以满足后面的测定需求。

2.4试剂的使用不同批号、不同厂家的试剂，由于酶标记物中酶的浓度不尽相同，与固相载体上的相应抗原或抗体发生特异性反应的程度不同，故不能混合使用。对于超过有效期的试剂则严禁使用。

3试验操作中的因素

3.1加样1)加样时间过长，尤其是手工加样时间过长，会导致孔间差异加大，更不可先把阴阳性及质控血清加好后长时间等待。2)加酶试剂及样品时，要加在孔底，不能加在孔壁上使用滴瓶滴加试剂时，滴加的角度不同和挤压的力度不同，致使滴加的试剂量不准，都可导致试验结果不准确。

3.2温育的影响温育对于ELISA检测梅毒螺旋体抗体是最关键的因素，温育时间、温度的选择一般根据试剂盒的说明书选择温育的时间、温度。加完标本和(或)试剂后将微孔板从室温放入水浴箱或温箱中时，孔内温度从室温升至37℃需要一定时间，如果是将微孔板一放人温箱即开始计时，这样就容易造成实际测定中温育时间不够，易致弱阳性标本测不出来。

3.3“边缘效应”的排除“边缘效应”是在使用96孔板的ELISA测定中，外周孔显色较中心孔深的现象。产生的原因可能是96孔板周围孔与中心孔在温育中的热力学梯度造成的，因此在温育时尽量采用水浴。

3.4洗板ELISA测定的洗板一般有2种方式，即手工和洗板机洗板。一般认为机器洗板较手工洗板效果要好，关键是洗板次数的选择。洗板次数较少，造成残留，可引起假阳性结果。洗板次数过多，可造成抗原抗体结合物洗脱，造成假阴性结果。

3.5显色市售ELISA试剂盒中，如以四甲基联苯胺(TMB)为底物，则提供的底物为A和B2瓶应用液；如以邻苯二胺(OPD)为底物，则试剂盒提供邻苯二胺片剂或粉剂。显色反应条件为37℃或室温反应15～30min。以邻苯二胺(OPD)为底物的试剂，要临用前30min配制且必须避光。以四甲基联苯胺(TMB)为底物的试剂则不需避光，但A、B液应尽量避免接触金属器械。其次，显色的时间要足够，在实际的操作中，往往对于显色的时间不够重视，显色时间过短容易造成弱阳性标本的漏检。显色时间过长会使质控值偏高，影响质控图的绘制。

3.6结果判定读取结果要在试剂说明书规定的时间内完成，定性测定用肉眼判读试验结果时，反应板应水平距离白色背景10～15cm；定量测定时用酶标仪读取结果，酶标仪不应置于阳光或强光照射下，需先预热15—30min再进行测试。

综上所述，尽管ELISA检测梅毒螺旋体抗体操作简单，但影响测定结果的因素也较多。故在实际操作的过程中，只有加强质量管理，避免或减少影响因素，才能保证血液检测质量，为临床提供合格安全的血液。

参考文献

[1]李金明.临床ELISA测定操作中的注意事项／／李金明.临床酶免疫测定技术.北京：人民军医出版社，2005：87-94.

[2]李会英.酶联免疫吸附实验影响因素的分析.检验医学与临床，2007，4(10)：985-986.