rAd-p53瘤内注射前后鼻咽癌组织中podoplanin的表达及临床意义

rAd-p53瘤内注射前后鼻咽癌组织中podoplanin的表达及临床意义

江河兰桂萍翁敬锦司勇锋丁志敏韦海明

江河1兰桂萍1翁敬锦1司勇锋1丁志敏2韦海明2

（1广西壮族自治区人民医院耳鼻咽喉头颈肿瘤科广西南宁530021)

(2广西壮族自治区人民医院病理科广西南宁530021）

摘要】目的探讨行重组人p53腺病毒（rAd-p53）瘤内注射前后的鼻咽癌原发灶中淋巴管的表达情况。方法63例确诊中晚期鼻咽癌的患者随机分为2组。治疗组（32例）：rAd-p53瘤内注射+同步放化疗。对照组（31例）：同步放化疗组。分别收集临床资料及rAd-p53瘤内注射前后鼻咽部瘤体活组织标本。采用免疫组化二步法检测鼻咽癌原发灶组织中淋巴管（podoplanin）的表达情况。结果治疗组podoplanin蛋白表达较治疗前明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。而对照组podoplanin蛋白表达较治疗前降低不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论rAd-p53可能通过某种机制抑制鼻咽癌淋巴道转移。

【关键词】鼻咽癌rAd-p53淋巴管

【Abstract】Objective:Toevaluatetheexpressionoflymphaticvesselsofthelineofrecombinanthumanp53adenovirus(rAd-p53)afterintratumoralinjectionofNPCprimarytumors.Methods:63patientsdiagnosedwithadvancednasopharyngealcarcinomawererandomlypidedinto2groups.Treatmentgroup(n=32):rAd-p53intratumoralinjectionandconcurrentradiotherapyandchemotherapy.Thecontrolgroup(n=31):Concurrentradiotherapyandchemotherapygroup.Clinicaldatawerecollected,andrAd-p53afterintratumoralinjectionofnasopharyngealtumorbiopsyspecimens.Two-stepimmunohistochemicaldetectionofnasopharyngealcarcinomainprimarytumortissuelymphatic(podoplanin)expression.Results:podoplaninexpressionwassignificantlylowerthanthatbeforetreatment,thedifferencewassignificant(P<0.05).Whilethecontrolgroupcomparedwithpodoplaninexpressionwasnotobviousbeforetreatment,thedifferencewasnotstatisticallysignificant(P>0.05).Conclusion:rAd-p53maybeinhibitedbysomemechanismofnasopharyngealcarcinomalymphnodemetastasis.

【Keywords】nasopharyngealcarcinomarAd-p53lymphatic

鼻咽癌是我国常见的头颈部鳞癌。放射治疗是鼻咽癌的主要治疗手段，治疗失败的主要原因是局部复发和远处转移。rAd-p53是通过腺病毒载体将野生型p53基因转导入肿瘤细胞发挥治疗效应，已成为一种有效的基因治疗途径。我们通过免疫组化检测方法了解rAd-p53瘤内注射前后podoplanin蛋白的表达情况，为rAd-p53治疗提供理论依据。

1材料与方法

1.1临床资料

本组63名病例源于广西壮族自治区人民医院耳鼻咽喉头颈肿瘤科在2007年01月～2010年06月收治的部分鼻咽癌患者，全部病例经病理诊断为未分化非角化性癌，并按研究病例的纳入条件、排除条件入组。入组病例按随机分为2组，治疗组：rAd-p53瘤内注射+同步放化疗，对照组：同步放化疗。

1.2病例选择方法

1.2.1病例纳入条件

经病理诊断为鼻咽癌，未行抗癌治疗；全部病例均行鼻咽颅底CT（或MRI）、B超、X线及鼻内窥镜检查了解病变范围；按UICC（1997）鼻咽癌分期方案分期的Ⅲ、Ⅳ期鼻咽癌患者；年龄在20-60岁之间；卡氏评分≥70分；签署知情同意书。

1.2.2病例排除条件

有远处转移者；研究期间需要增加任何其他抗肿瘤伴随治疗；有不能控制的感染者；有神经系统严重病变者（如急性脑卒中）、有出血倾向性疾病者、有严重的内分泌疾病者、有较严重的肝肾功能损伤者；研究者判断患者依从性差，无法按照要求完成研究。

1.2.3病例剔除条件

因使用rAd-p53出现高热不能耐受者；患者在用药期间发生了不良事件或者严重不良事件，研究医生判断不适于继续参加研究；患者由于某些与研究无关的客观原因要求退出试验。

1.3治疗方法

1.3.1放射治疗

采用西门子Primus全数字化直线加速器常规体外照射，采用面颈联合野照射36Gy后缩野，采用耳前野辅以鼻前野，原发灶70-76Gy/35f/7-8w，颈转移灶60-70Gy。

1.3.2化学药物治疗

卡铂+5-Fu方案。剂量按体表面积计算，卡铂500mg（m2·d）-1，d1静脉点滴，5-Fu500mg（m2·d）-1，d1-5，24小时微泵持续输入，同时应用昂丹司琼注射液止吐治疗，与放疗同步进行，21天后重复化疗1次，共2个周期。

1.3.3rAd-p53瘤内注射

重组人p53腺病毒注射液（rAd-p53,中国深圳赛百诺公司生产）剂量：1×1012VP/支，1次/周，治疗6-8周；用法：用生理盐水稀释rAd-p53到2ml后使用，在鼻内镜直视下多点注入鼻咽部原发灶内；用药时间：于放疗前48-72小时行瘤内注射。

1.4鼻咽癌原发灶标本获取方法

分别于治疗前及放疗20Gy或鼻咽部瘤体组织即将消退前获取活体组织标本。用1％麻黄素液和1％的卡因液棉片行鼻腔、鼻咽部粘膜麻醉，在鼻内窥镜直视下于鼻咽部瘤体处应用活检钳获取活体组织标本。

1.5试剂

免疫组化ElivisionTMplus二步法试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司，DAB显色试剂盒、鼠抗人podoplanin单克隆抗体均购于北京中杉生物技术公司。

1.6免疫组织化学检测

全部标本经4%甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋，切片（4μm），HE染色，光镜检查。采用ElivisionTMplus二步法，根据试剂说明书操作进行podoplanin蛋白检测。

1.7图像分析及结果判定

podoplanin阳性表达于淋巴管内皮细胞胞膜和胞质，呈棕黄色颗粒。采用Weidner法计数：先在低倍镜下寻找新生脉管最密集的区域即热点（hotSPOt），然后在高倍镜下对淋巴管进行计数，在肿瘤组织内以5个高倍镜视野脉管的平均数表示脉管数。

1.8随访

随访时间是2007年01月至2010年08月，随访方式是患者定期回院复查和专职随访员电话随访。

1.9统计学分析

计数资料采用均数±标准差表示，所有分析均使用SPSS13.0统计学软件进行统计学处理，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1一般资料

按照病例纳入条件和排除条件入组病例63例，男52例，女11例，年龄在22～63岁之间。按UICC（1997）鼻咽癌分期方案分期：Ⅲ期37例，Ⅳ期26例。治疗组入选病例32例，对照组入选病例31例。治疗前两组原发肿瘤大小、年龄、性别、临床分期、T分期、N分期间差异无统计学意义（P＞0.05）,见表1。

2.2podoplanin在鼻咽癌组织中的表达

podoplanin蛋白的阳性表达见于所有肿瘤组织，分布在肿瘤实质和外周，呈一致性的管腔结构，有一层薄壁，管腔内很少有淋巴细胞，无红细胞，肿瘤周边淋巴管腔比实质内大，而且数量多，见图1。

2.3两组治疗前后podoplanin蛋白的表达情况

治疗组podoplanin蛋白表达较治疗前明显降低，差异有显著性意义（P＜0.05）。而对照组podoplanin蛋白表达较治疗前降低不明显，差异无显著性意义（P＞0.05）见表2。

3讨论

p53基因是正常细胞内关键的看家基因，是最重要的一个抑癌基因。其通过以下作用实现抑癌作用：①细胞周期阻滞、促进损伤细胞修复；②诱导严重受损细胞凋亡；③调节机体免疫反应；④抑制生存增殖信号途径；⑤抑制血管生成及物质能量代谢；⑥抑制细胞—细胞黏附及其浸润转移。研究表明：50%以上人类肿瘤存在p53抑癌基因的突变或缺失[1]，而且p53突变与肿瘤细胞对常规化疗药物及放射治疗敏感性下降有关[2]。实验已证实，将野生型p53基因导入肿瘤细胞，可以控制细胞周期和诱导细胞凋亡、增加肿瘤对化/放疗的敏感性[3]，还可通过旁观者效应达到杀灭肿瘤细胞的目的[4]。大量基础和临床前研究结果为p53治疗应用于肿瘤临床提供了充分的依据和坚实的基础。rAd-p53是将野生型p53基因插入缺陷型腺病毒构建而成的国家I类新药。

微血管和淋巴管系统一直被认为在恶性肿瘤侵袭和转移过程中扮演着重要的角色。前些年，微血管生成的研究成为众多学者的研究热点。近年来，随着系列淋巴管特异性标志物，如肾小球足突细胞膜粘蛋白(podoplanin)、D2—40、血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-3)、淋巴管内皮透明质酸酶受体-1(LYVE-1)和Prox-1等的发现，对肿瘤新生淋巴管的研究逐步深入，这使得肿瘤淋巴管生成与肿瘤转移和预后的关系研究成为继肿瘤血管生成之后新的研究热点[5]。

podoplanin是一种相对分子质量为38×10的I型跨膜糖蛋白，由162个氨基酸构成，有1个单一高度保守的跨膜区域，胞内域有9个氨基酸构成，细胞质内的C端有2个潜在的磷酸化位点，胞外域随物种不同而变异较大，但都有相对保守的6个潜在的氧连接型糖基化位点，唾液酸通过α-2，3连接在半乳糖上，构成该蛋白的糖类主要部分[6]。podoplanin在人体多种组织细胞中表达，如在肾足突细胞、骨骼肌、胎盘、肺和心脏、乳腺的肌成纤维细胞、唾液腺、成骨细胞和间皮细胞上，也在鼠肺泡I型上皮细胞膜上表达[7-8]，偶尔在人表皮细胞的基底层上也能见到局部表达，但主要表达在淋巴管内皮上，是淋巴内皮细胞的特异性标志物。

我们通过免疫组化检测发现rAd-p53瘤内注射后鼻咽癌原发灶组织中podoplanin蛋白表达较治疗前明显降低，差异有显著性意义（P＜0.05）。而对照组podoplanin蛋白表达较治疗前降低不明显，反而有轻微的增高，差异无显著性意义（P＞0.05）。所以我们有理由相信，rAd-p53可能通过某种机制抑制鼻咽癌组织内淋巴管生成，从而抑制鼻咽癌的淋巴道转移途径，这正验证了p53基因能够抑制细胞—细胞黏附及其浸润转移的抑癌机制。

表1两组患者的一般情况

表2两组患者治疗前和治疗后鼻咽癌原发灶podoplanin蛋白的表达情况

图1

Podoplanin蛋白在鼻咽癌组织中的表达免疫组化×200

参考文献

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[5]李秀霞，孟冬月.肿瘤淋巴管生成的研究进展[J].中国老年学杂志，200828(14)：1452—1454.

[6]BRE1TENEDER-GELEFFs，SOLEIMANA，KOWALSKIh，etal.AngiosarcomasexpressmixedendothelialpHenotypesofbloodandlymphaticcapilaries：podoplaninasaspecificmarkerforlymphaticendothelium[J].AmJPathol，1999，154(2)：385-394.

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