MicroRNA-101表达上调影响乳酸形成抑制胃癌细胞增殖

MicroRNA-101表达上调影响乳酸形成抑制胃癌细胞增殖

王亚明张桂东王涛孔维赵曙虹温桂海王杰

王亚明1张桂东1王涛孔维1赵曙虹2温桂海1王杰3王静4通讯作者

1.邯郸市中心医院东区普外一科河北邯郸056001；

2.邯郸市中心医院神经外一科河北邯郸056001；

3.邯郸市中心医院泌尿外二科河北邯郸056001；

4.邯郸市中心医院病理科河北邯郸056001

【摘要】胃癌是世界范围内最重要的肿瘤之一，我国是重灾区，全球范围内每年有上百万的新发病例，严重威胁了人类的健康。虽然近年来在胃癌治疗取得了显著进展，但效果仍旧无法满足人们的健康需求。microRNAs是一类在生长、发育、疾病发生过程中具有重要调节作用且进化保守的一类小的非编码RNAs。葡萄糖糖酵解成丙酮酸，后者选择生成乳酸的异常代谢是肿瘤细胞的一大特征。本研究利用转染技术将microRNA-101在胃癌细胞系内上调表达，分析其对胃癌细胞代谢的影响。通过实验我们发现，micoRNA-101高表达后，胃癌细胞增殖受到抑制，同时胃癌细胞乳酸脱氢酶的表达下降，进而影响细胞培养基内乳酸的浓度。所以，本研究说明microRNA-101可能是通过影响胃癌细胞的糖代谢进而达到抑制胃癌细胞增殖的目的。

【关键词】胃癌；MIR-101；乳酸

【中图分类号】R735.2【文献标识码】B【文章编号】1674-8999（2015）9-0612-01

胃癌是世界上最重要的肿瘤之一，全球范围内每年有上百万的新发病例，严重威胁了人类的健康[1]。在胃癌细胞内，相关分子机制研究表明，正常水平表达的miR-101可以通过抑制EZH2、E-cadherin、COX2等基因，促进细胞凋亡、抑制细胞增殖[2-3]。综合已有研究证据，我们推测miR-101在抑制胃癌细胞恶性行为的过程中，可能参与了胃癌细胞的代谢过程，本研究着眼于此，探讨microRNA-101在胃癌的葡萄糖代谢产生乳酸过程中的作用，进一步明确micro-101抑制胃癌作用的分子机制。

1材料与方法

1.1细胞培养

本实验用人胃癌细胞SGC-7901和MGC-803购自中科院上海细胞库（上海，中国），培养在含有10%胎牛血清（FBS，Gibco，美国）、2mM的L-谷氨酰胺、100mg/L的链霉素、100千单位的青霉素的RPMI1640（Gibco，美国）培养基内，置于含有5%CO2的37℃培养箱内进行培养。

1.2microRNA-101合成及细胞转染

MiR-101的正向序列（5’-UACAGUACUGUGAUAACUGAA-3’）和反向序列（5’-UUCAGUUAUCACAGUACUGUA-3’）根据miRbase数据确定，其miR-101及对照由上海吉玛制药技术有限公司合成（吉玛，中国），同时合成有荧光标记的双链RNA片段作为转染效率检测序列。胃癌细胞铺板于6-孔板内，当生长密度达到30-60%时，将miRNA-101、对照序列以及荧光内参序列溶解入Opti-MEM（Gibco，美国），静置后加入公司提供的转染试剂内，混匀后静置10min左右，加入到培养板内。第二天观察转染效率，转染效率达标细胞用于后续试验。

2结果

2.1miR-101能够抑制胃癌细胞的增殖和转移

为了检测miR-101对胃癌细胞增殖的影响，我们利用转染后的胃癌细胞和MTS试剂检测细胞的增值情况。通过在24、48和72h的测定，我们发现miR-101表达上调的细胞与对照细胞相比，增值速度显著降低（p<0.05）。如图1所示。

在72h后，miR-101的表达上调后的胃癌细胞增殖显著减慢，SGC7901-miR101mimic和MGC803-miR-101mimic分别低于NC细胞。

2.2miR-101能够引起LDHA胃癌细胞的表达降低

在本实验中，我们利用荧光定量PCR技术和WesternBlot技术发现，miR-101高表达的胃癌细胞内LDH-A的表达水平（mRNA水平和蛋白水平）相比于对照细胞都显著降低。这可能提示我们miR-101可能通过影响LDH-A的功能进而影响胃癌细胞增殖。如图2和图3所示。

2.3细胞代谢出的乳酸降低

在发现了LDH-A的表达水平随着miR-101的转染增高后，我们接着检测了细胞培养上清内乳酸浓度。利用乳酸试剂盒检测发现，如所预期一致，miR-101的水平升高后，乳酸的浓度在SGC7901和MGC803的培养基中浓度降低。这说明，miR-101可通过改变LDH-A的水平，直接响了胃癌细胞乳酸的代谢和分泌，导致细胞培养上清中乳酸浓度降低。如图4所示。

3讨论

胃癌的发病率在我国多年来一直居高不下，是我国人民面对的最主要的恶性肿瘤之一，这可能与我国人民长期的饮食习惯有密切关系。在本实验中，我们首先根据miRbase数据库合成了miR-101的序列，转染胃癌细胞SGC7901和MGC803使之表达上调后，我们发现miR-101能够降低胃癌细胞的增殖，同时会降低乳酸脱氢酶的表达水平（mRNA和蛋白），并伴有细胞乳酸分泌减少。我们推测miR-101对胃癌细胞的抑制作用可能是通过影响LDH-A进而影响乳酸的产生而实现的。此结论仍需进一步的深入验证讨论。

胃癌分子机制和攻克还有很长的路要走，而microRNAs在胃癌的发生、发展过程中的复杂作用还有许多的工作要做，miRNAs影响胃癌代谢进而抑制肿瘤，这可能是未来胃癌研究和药物研发的一大热点领域。

参考文献：

[1]JemalA,BrayF,CenterMM,FerlayJ,WardE,FormanD:Globalcancerstatistics.CA:acancerjournalforclinicians2011,61(2):69-90.

[2]HeXP,ShaoY,LiXL,XuW,ChenGS,SunHH,XuHC,XuX,TangD,ZhengXFetal:DownregulationofmiR-101ingastriccancercorrelateswithcyclooxygenase-2overexpressionandtumorgrowth.TheFEBSjournal2012,279(22):4201-4212.

[3]WangHJ,RuanHJ,HeXJ,MaYY,JiangXT,XiaYJ,YeZY,TaoHQ:MicroRNA-101isdown-regulatedingastriccancerandinvolvedincellmigrationandinvasion.Europeanjournalofcancer2010,46(12):2295-2303.

项目资助：

邯郸市科学技术与发展规划项目

作者简介：

王亚明：男，本科，主治医师，研究方向：消化系统肿瘤的发病机制及综合治疗。

通讯作者：

王静