RT-PCR在诺瓦克病毒检测中的应用分析

RT-PCR在诺瓦克病毒检测中的应用分析

秦金勇

秦金勇（桂林市疾病预防控制中心541001）

【中图分类号】R446.61【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）06-0124-01

【摘要】目的对桂林市一起旅游团体腹泻疫情进行诺瓦克病毒Ⅰ型(NVGⅠ型)和Ⅱ型（NVGⅡ型）检测分型，为疫情处理及时做出准确的判断。方法用实时荧光探针（RT-PCR）方法对腹泻病人样本的特异引物进行核酸扩增检测。结果通过用实时荧光PCR法对28份样品进行快速检测，NVGⅠ型阳性6份（21.4﹪），NVGⅡ型阳性3份（10.7﹪），NVGⅠ型和NVGⅡ型同时阳性1份（3.6﹪），阴性19份（67.9﹪）。结论实时荧光PCR在诺瓦克病毒检测中能起到快速、准确和高灵敏的效果，对病人病情的及时诊断治疗和对突发疫情的快速控制和处理起到了积极的作用。

【关键词】NVGⅠ型NVGⅡ型实时荧光PCR

诺瓦克病毒（NorwalkViruses，NV）是人类杯状病毒科(HumanCalicivirus，HuCV)中诺如病毒（Norovirus,NV）属的原型代表株。NV是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。诺瓦克病毒最早是从1968年在美国诺瓦克市暴发的一次急性腹泻的患者粪便中分离的病原。诺瓦克病毒感染全年均有流行，感染对象主要是成人和学龄儿童，主要分布在学校、家庭、医院、军队、幼儿园和旅游区等，多在集体机构以暴发形式出现。2012年5月桂林市发生一起旅游团体腹泻事件，通过采集病人呕吐物、食物及水样20余份，采用实时荧光探针（RT-PCR）方法进行诺瓦克病毒Ⅰ型(NVGⅠ型)和Ⅱ型（NVGⅡ型）快速检测，现将实验结果报告如下：

1、材料与方法

1.1样本来源采集桂林市漓江游船上出现呕吐、腹泻病人的呕吐物、粪便及船上食物共计28份，样本置于无菌采样瓶和HANK’S病毒采样管，带冰运送至实验室。

1.2方法

1.2.1病毒RNA提取：取黄豆颗粒大小粪便、100ul水样腹泻物或呕吐物样品置于1.5ml离心管中，加入300ul裂解液（Trizol），再加入100ul氯仿，按照提取盒说明要求进行核酸提取。

1.2.2主要试剂：诺瓦克病毒核酸测定试剂盒的配套试剂及质控品购自上海之江生物科技有限公司，在有效期内使用，PCR扩增仪为美国ABI7500型。

1.2.3样品检测根据试剂盒说明书要求，将内部对照品10倍稀释。根据样品数量，取相应量的NVGⅠ型和NVGⅡ型核酸荧光检测混合液、10倍稀释的内部对照品以及RT-PCR酶混合均匀，离心数秒，取上述混合液20ul置于薄壁PCR反应管，然后将已处理好的标本RNA、阳性对照品、阴性对照品各5ul分别加入薄壁PCR反应管中，盖好薄壁PCR反应管盖，立即进行PCR扩增反应。

1.2.4PCR扩增反应管置于PCR仪上，荧光通道检测选择可用FAM通道或HEX通道。Passivereference和quencher处均选择none。循环参数设置为45℃×10min；95℃×15min；再按95℃×15sec→60℃×60sec，循环40次；单点荧光检测在60℃.反应体系为25ul。

2、结果

待检样品ct值≤38判定为阳性，待检样品ct值＞38判定为阴性。阳性对照品通道ct值在23～33之间；阴性检测通道显示UNDET。通过用实时荧光PCR法对28份样品检测，其中NVGⅠ型阳性6份，阳性率21.4﹪（6/28），NVGⅡ型阳性3份，阳性率10.7﹪（3/28），NVGⅠ型和NVGⅡ型同时阳性1份，阳性率3.6﹪（1/28）。

3、讨论

诺瓦克病毒引起的急性胃肠炎发病突然，症状严重，若采取细菌或者病毒培养，不仅花费时间长，培养几率低，而且还会延误疾病的诊断和疫情的控制。本次试验采用实时荧光PCR方法检测，根据试剂盒针对NVGⅠ型和GⅡ型高度保守区域设计特异性引物和探针，在反应体系中含诺瓦克病毒基因组模板的情况下，PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用ABI7500PCR仪对PCR整个过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果定性分析。整个试验过程仅用四个小时就可以判定结果，不仅能更快速、准确、灵敏地检测标本中的NV，尤其是低浓度的NV感染亦能准确检测出，对诺瓦克病毒引起的胃肠炎及其并发症的诊断，疫情及时控制和处理及疗效评估有重要的指导意义。最大的优点在于可以快速的检测定性分型，进一步对病毒进行基因型的研究，不会受到获得分型单克隆抗体的限制，对流行病学研究具有重要意义。

参考文献

[1]司红丽,王健伟,徐樨巍,王建华,屈建国,洪涛.检测粪便中GGⅡ型诺如病毒Real-timeRT-PCR方法的建立[J].病毒学报.2006年03期.

[2]郭秋平.新型实时荧光PCR检测体系的研究和应用[D].厦门大学,2001年.

[3]金大智.运用实时荧光PCR和DNA芯片技术检测和鉴定食源性致病菌方法的研究[D].辽宁师范大学,2004年.