p16基因与口腔癌的研究进展

p16基因与口腔癌的研究进展

卢淼

湖南省湘潭市第一人民医院411101

【摘要】口腔癌是头颈部较常见的恶性肿瘤之一，90%的为鳞状细胞癌（oralsquamouscellcarcinomaOSCC）。p16基因是已知的重要抑癌基因，迄今为止，已经在人类的许多恶性肿瘤及头颈部肿瘤中检测到p16基因的异常［1］。本文就p16基因的表达与口腔癌的发生发展作一综述，为口腔癌的治疗和控制提供参考。

【关键词】口腔癌；p16基因；表观遗传学；DNA甲基化

口腔癌是人类第六大恶性肿瘤，，其五年总体生存率在50%左右，而早期癌的5年生存率可达80%［1］。由此看来，口腔癌的预后在于早期发现。若能及早对癌前病变进行持续监测和干预，将有很大可能阻断甚至逆转其进展为癌。那么首要任务是要对癌前病变做出正确的诊断。表观遗传学是研究在没有细胞核DNA序列改变的情况时，影响基因的表达。这些改变包括DNA的修饰（如甲基化修饰、组蛋白修饰、非编码RNA等）。在抑癌基因中甲基化研究得较深的是p16基因。

p16基因简介

1.1p16基因的结构

p16基因（multipletumorsuppressor1MTS）基因，是一种多肿瘤的抑制基因。1994年美国冷泉港实验室Kamb的研究小组在黑色素瘤细胞中发现了一种蛋白质，他们利用染色体步移技术和定向测序技术在染色体9p21区域发现有一个等位基因突变和另一个等位基因缺失，他们将此新的基因命名为p16基因［2］。

p16基因位于人类第9号染色体短臂2区1带，由2个内含子及3个外显子组成，第1外显子由126bp组成，第2外显子由307bp组成，第3外显子11bp组成。

1.2p16基因的作用机制

细胞周期调节是一复杂过程，研究发现一类基因与细胞周期调节密切相关，即细胞分裂周期基因（cellpisioncycle，cdc基因），它们控制着细胞周期的启动及各时相的转换。Cdc（cellpisioncycle）基因编码产物是蛋白激酶，参于调控G1-S，G2-M的关键点转换，这种控制细胞分化的机制涉及到多种组成成分，最重要的是细胞周期素（cyclin又叫循环素）的周期性累积与分解对细胞周期时程的调控作用，其中CDK（cyclin-dependentkinase）与cyclin的复合体分别在细胞周期的不同时相发挥作用，启动DNA复制及诱发有丝分裂［3］。p16基因表达产物为3个外显子共同编码的细胞周期蛋白依赖性激酶4（cyclin-dependentkinaseCDK4）的抑制蛋白，即p16蛋白。DavidBeach等证明了P16蛋白是作用于细胞分裂周期（CellpisionCycle）关键酶之一的CDK（cyclin-dependentkinase）4的抑制因子，最终阻止细胞进入S期［4］。一旦P16基因缺失，突变等导致功能缺失，则不能抑制CDK4，最终细胞进入恶性增殖，加速肿瘤发生发展。CDK4-cyclin可作用于多种癌基因产物如PP60c-sYc，C-abl产物，对其进行磷酸化修饰调节，亦可作用于某些抗癌基因产物，如在G1/S交界处，CDK4-G1cyclin使Rb磷酸化而失活，细胞从静止态进入增殖态。总之，一旦p16功能缺失，则不能抑制细胞周期蛋白激酶CDK4，细胞则进入恶性增殖，最终形成肿瘤。

2.p16基因的失活与口腔癌的发生

P16基因已经在多种肿瘤中发现缺失，突变异常，启动子异常甲基化。

P16基因缺失包括单等位基因的杂合性缺失和双等位基因的纯合性缺失，其中以纯合性缺失为主。在口腔癌中p16基因的缺失比突变更常见［5］。

p16基因突变包括移码突变、无义突变及错义突变，以错义突变为主。p16基因的突变多是点突变，即可发生在启动子区，编码区和非编码区。Tsai在p16基因的研究中发现，点突变主要发生在第2外显子［6］。Weber等对50例口腔鳞癌p16基因标本中经PCＲ扩增p16基因第二外显子后，结果发现有6例发生了点突变。近年亦有研究显示在33例口腔鳞癌中研究发现两例点突变，突变率为6%。由此看来p16基因的突变与口腔癌的发生起到了一定的作用［7］。

DNA甲基化是基因外修饰，不改变DNA的一级结构。在哺乳动物基因中，大部分的DNA甲基化是指CpG二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子在甲基转移酶（DNAmethyltransferaseDNMT）催化作用下被甲基化。若DNA甲基化则会抑制该段DNA上的基因表达。p16基因外显子1启动子富含CpG结构，故常见该部位甲基化，这一部位甲基化抑制了启动子的活化，从而导致p16基因转录失活。有研究表明p16基因的高甲基化发生在口腔黏膜癌变的早期，高甲基化可导致抑癌基因失活从而引起癌的发生［8］。Cao等对78例口腔黏膜轻度和中度异常增生患者平均4年的随访发现，存在p16基因甲基化的口腔黏膜异常增生患者44％进展为口腔癌，显著高于不存在p16基因甲基化患者的17％，（OR＝3．7，P=0.013）［9］。FUJie等采用内切酶消化法和实时定量PCR的方法对87例口腔白斑和口腔癌39例、20例正常口腔黏膜为对照。结果显示正常口腔黏膜中，P16基因启动子区处于未甲基化状态，口腔白斑中P16基因甲基化阳性率为41.38%，与正常对照相比显著增高（P<0.001）；口腔鳞癌P16基因甲基化阳性率为20.51%，与正常对照相比明显增高（P<0.05）［10］。邓大君研究团队通过为期3年的多中心临床队列随访研究证明p16甲基化在肿瘤发生前2~3年就能够早期判断出这种癌前病变的癌变可能性，，临床灵敏度为62%，临床特异性为76%，这说明了P16基因甲基化可作为口腔黏膜上皮异型增生癌变的预测标志物，这一突破性发现为人类提供了第一个上皮异型增生癌变能力判断标志物，对于这类癌前病变患者的个体化治疗方案的制订具有重要指导作用［11］。同时，近来，国内有研究显示p16基因启动子CpG岛甲基化现象与舌鳞癌的发生发展关系密切；癌症发展越晚期、肿瘤浸润更深、发生转移、更低分化者p16基因启动子CpG岛甲基化的频率更高，但与患者年龄、性别等因素无关［12］。

3.p16基因甲基化及叶酸缺乏与口腔癌的发生

叶酸（Folicacid）属于B族维生素，又称是蝶酰谷氨酸（Pteroylglutamicacid，PGA）。叶酸是由蝶呤啶、对氨基苯甲酸与L—谷氨酸结合而成。在体内叶酸加氢可还原成二氢叶酸并进而在二氢叶酸还原酶作用下还原成叶酸的活性型—5，6，7，8-四氢叶酸（FH4）。叶酸的重要生理功用是作为一碳化合物的载体参加代谢。动物实验及分子流行病学证实，叶酸缺乏可影响基因突变频率以及癌基因与抑癌基因的平衡，导致肿瘤的发生，尤其是胃肠道肿瘤和恶性程度较高的血液肿瘤的发生［13-14］。叶酸供甲基作用参与维持DNA的甲基化状态，抑制肿瘤癌基因的表达。研究显示，叶酸缺乏可通过干扰DNA甲基化和DNA合成而参与致癌过程［15］。叶酸缺乏导致DNA甲基化的模式改变，主要与S-腺苷甲硫氨酸合成有关。S-腺苷甲硫氨酸是细胞内各种甲基化反应的通用供体，一旦叶酸缺乏将造成甲基来源不足而影响核酸的甲基化。DNA低甲基化首先会引起DNA非转录区域的改变，导致潜在的有害基因的表达，如插入的病毒基因、非转录基因、原癌基因激活等；同时，DNA低甲基化也有利于基因重复子的同源性重组，增加了整个基因组的不稳定性。shiff等［16］研究结果显示，叶酸缺乏可导致抑癌基因p53编码区域低甲基化，补充叶酸则可逆转该区域发生的低甲基化现象，随着病情加重，CpG岛甲基化增加，非CpG岛位点甲基化减少。2002年，Weinstein在其研究中证实叶酸的摄入可以降低口腔癌的风险（OR：0．6；95％CI：0．4～1．0）［17］。诸多研究已证实了P16基因甲基化在口腔癌变过程中有不可忽视的作用，并且叶酸与DNA甲基化之间又存在不可分割的内在联系，提示叶酸可能通过对p16基因甲基化的调节而作为协同因子在口腔癌变过程中发挥作用。然而叶酸缺乏与p16基因甲基化的关系以及在口腔癌的发生发展中的机制研究甚少。

综上所述，p16基因异常与口腔癌的发生、发展有关，可作为口腔癌诊断的分子生物学标志之一，尤其是作为口腔黏膜上皮异型增生癌变能力判断标志物，对于口腔癌的早期诊断具有重要意义。同时，也为及早制定正确合理的治疗方案提供了依据。然而，目前叶酸缺乏与口腔癌的发生及其发生机制以及体内叶酸水平与p16基因甲基化的关系，两者在口腔癌的发生过程中是否有协同作用尚未阐明，还需进一步探索。

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