精胺对Ox-LDL介导的内皮细胞损伤的作用及机制研究

精胺对Ox-LDL介导的内皮细胞损伤的作用及机制研究

杨金霞1*,汪雨2,李倩1,王琳3,梁春红1

（1大庆医学高等专科学校病理与病理生理学教研室,2大庆油田总医院B超室,3大庆医学高等专科学校生理学教研室,黑龙江大庆163312）

[摘要]目的：建立Ox-LDL诱导内皮细胞损伤模型，观察外源性精胺对细胞凋亡及信号通路的影响，探讨精胺减轻细胞损伤的可能机制。

方法：建立Ox-LDL损伤细胞模型后，给予外源性精胺后检测各组细胞凋亡及凋亡相关蛋白的表达情况。

结果：Ox-LDL组内皮细胞总凋亡率明显高于Control组和Sp组，Ox-LDL上调了磷酸化p38活性，差异具有统计学意义（P<0.05）；精胺预处理后，内皮细胞凋亡率较Ox-LDL组明显减少，降低了磷酸化p38的活性，差异具有统计学意义（Ｐ＜0.05）。

结论：外源性精胺可减轻Ox-LDL诱导内皮细胞损伤及凋亡，其机制可能通过抑制线粒体凋亡信号通路，发挥对内皮细胞的保护作用。

[关键词]精胺；Ox-LDL；细胞凋亡

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是心脑血管病的主要病因，严重危害人类健康。氧化应激与动脉粥样硬化的发生发展密切相关[1]。具有细胞毒性作用的氧化型低密度脂蛋白（oxidizedlowdensitylipoprotein，Ox-LDL），被认为是导致AS发生发展的独立危险因素，能诱导血管内皮细胞凋亡，进而启动AS的发生[2]。精胺(Spermine,Sp)是带有四价阳离子的生物胺，具有抗炎、抗氧化、清除自由基、抗凋亡等作用[3]。

本研究通过建立Ox-LDL损伤细胞模型后，给予外源性精胺后检测各组细胞凋亡及凋亡相关蛋白的表达情况，探讨精胺减轻细胞损伤的可能机制。

材料和方法

1材料及仪器

1.1实验对象人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)，购自于北医肿瘤研究所。

1.2主要试剂及仪器精胺（sigma），Ox-LDL（北京协生生物科技有限责任公司），胰酶，DMEM培养基，胎牛血清，Hoechst33342染色试剂盒，AnnexinⅤ-FITC/PI染色试剂盒，P38抗体，倒置显微镜(日本OLYMPUS)，CO2培养箱(日本SANYO)，BIO-RAD550酶标仪（美国伯乐公司）等。

2HUVEC的复苏与传代培养

内皮细胞株复苏后，用含10%胎牛血清DMEM培养液接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中静置培养，待内皮细胞贴壁长满培养瓶底部后，进行细胞传代。取3-5代生长良好的细胞用于实验。

3实验分组

①Control组；②Sp组；③Ox-LDL组；④Sp+Ox-LDL；⑤Ox-LDL+SB203580；⑥Sp+Ox-LDL+SB203580组，均培养24h。

4观察指标

采用CCK-8测定细胞活力；Hoechst33342染色和AnnexinⅤ-FITC/PI染色检测细胞凋亡，蛋白免疫印迹技术检测P38蛋白表达。

5统计学处理

所有计量数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验，P<0.05表示差异显著。

结果

1HUVEC活力测定

与Control比较，Ox-LDL组细胞活力降低(P<0.05)；加入Sp后，增加细胞活力，与Ox-LDL组比较差异显著(P<0.05)。

2Hoechst33342染色

Control组和Sp组中，细胞核呈低蓝色占绝大多数，说明无明显细胞凋亡；Ox-LDL组中，细胞核呈高蓝色明显增多，细胞核呈现高亮、固缩和碎裂，提示凋亡细胞数目明显增加；Sp+Ox-LDL组中凋亡细胞数较Ox-LDL组明显减少(P<0.05)

3AnnexinⅤ-FITC/PI染色

Ox-LDL组内皮细胞总凋亡率明显高于Control组和Sp组，差异具有统计学意义（P<0.05）；精胺预处理后，内皮细胞凋亡率较Ox-LDL组明显减少，差异具有统计学意义（P<0.05）。

4磷酸化p38蛋白表达

Ox-LDL上调了磷酸化p38活性，与正常对照组比较，差异具有统计学意义（P<0.05）；与Ox-LDL组相比，精胺降低了磷酸化p38的活性，差异具有统计学意义（P<0.05）。

讨论

AS是一种缓慢进展的疾病，其发生发展是一个复杂的过程，其发病机制尚未完全清楚。与AS发病机制相关的学说主要有脂质浸润学说、内皮损伤学说、炎症学说、氧化应激反应学说和感染学说等。目前，仍没有完全阐明动脉粥样硬化的发生机制，因而对动脉粥样硬化的防治缺乏有效的措施。

通过检测细胞活力，确定了本实验所用的Ox-LDL浓度和精胺浓度；为了观察精胺对细胞损伤的影响，我们采用AnnexinⅤ-FITC/PI染色和Hoechst33342染色检测细胞凋亡，结果显示精胺减轻Ox-LDL诱导的细胞凋亡；为进一步探讨精胺减轻细胞凋亡的机制，我们测定了凋亡相关蛋白P38的表达情况，结果显示精胺降低了磷酸化p38的活性。有文献报道，精胺可抑制线粒体通透性转换孔开放，在小鼠WEH1231B细胞和人的T细胞，多胺合成抑制剂引起线粒体膜电位下降和Caspase-3激活，外源性多胺可逆转上述改变。我们的实验结果与文献报道相一致。本研究结果表明，外源性精胺可能通过抑制线粒体P38凋亡信号通路，减少Ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡，发挥对内皮细胞的保护作用。我们还将继续在分子水平研究精胺抗氧化的可能机制，为精胺防治动脉粥样硬化提供理论依据。

1.黄卫江,陈朝俊,付强.参七脉心通胶囊对动脉粥样硬化斑块稳定影响的实验

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2.PucaAA,CarrizzoA,VillaF,FerrarioA,CasaburoM,MaciągA,VecchioneC.

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