内脂素在急性坏死性胰腺炎并发肾损伤中的作用

内脂素在急性坏死性胰腺炎并发肾损伤中的作用

蔡莉1唐国都2许志毅1

蔡莉1唐国都2许志毅1

（1广西医科大学广西南宁530021）

（2广西医科大学第一附属医院消化内科广西南宁530021）

【摘要】目的观察大鼠急性坏死性胰腺炎（ANP）发病过程中肾脏组内脂素mRNA表达变化，探讨内脂素在ANP并肾损伤中的作用及意义。方法64只SD大鼠随机分为假手术对照组(C组)、急性坏死性胰腺炎组(A组)，各组32只。A组以1.5%脱氧胆酸钠溶液逆行注入胰胆管建立ANP模型，C组仅翻动胰腺后关腹。各组分别于造模后6h、12h、24h、48h时间点分批处死大鼠；采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测肾组织内脂素mRNA表达；胰、肾组织行病理切片观察，同时行血清淀粉酶、IL-6检测。结果A组6、12、24、48时点胰腺和肾脏病理评分、血清淀粉酶、IL-6、内脂素mRNA表达较同时点C组显著升高（均P<0.5）。A组大鼠随病程延长肾脏组织中内脂素mRNA表达逐渐增加，自6时起明显高于C组（均P<0.5），48h最高。结论在ANP发病过程中内脂素的表达在肾脏组织中逐渐增加，可能参与了ANP相关肾损伤过程。内脂素在并ANP并肾损伤时的表达升高可能与疾病的严重程度有关。

【关键词】急性胰腺炎肾损伤VisfatinIL-6

【中图分类号】R656.1【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）09-0389-02

ROLEOFVISFATININTHEPATHOGENESISOFAUTEPANCREATITIS-ASSOCIATEDKIDNEYINJURY

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheexpressionofvisfatininkidneytissureinratwithacutenecrotizingpancreatitis(ANP)associatedwithliverinjury，andtoexploretheroleofvisfatininthepathogenesisofANPassociatedwithkidneyinjury.METHODSSixty-fourmaleSprague-Dawley(SD)ratswererandomlyandequallypidedintoshamoperationgroup(groupC)andANPgroup(groupA)．RatofgroupAwasreducedbyretrogradeinjectionof1.5%sodiumdeoxycholate(1ml/kg)intothebiliary-pancreaticduct．Allratswereacrificedat6hours，12hours，24hoursand48hoursaftercorrespondingoperation.ThelevelofserumamylaseandserumIL-6wasdetected．Pancreasandkidneywereevaluatebypathologicalscore.ThemRNAexpressionofvisfatininkidneyweredetectedbyRT-PCR．RESULTSComparewithgroupC，Thepathologicscoresofthepancreasandkidney，thelevelofserum-amylaseandIL-6inserum，theexpressionofvisfatinIngroupAweresignificantlyincreaseat6hours，12hours，24hoursand48hoursaftercorrespondingoperation(P＜0.05).CONCLUSIONTheincreasedexpressionofvisfatinmaycloselyrelatedtothedevelopmentofkidneyinjuryinacutenecrotizingpancreatitis．

【Keywords】acutenecrotizingpancreatitiskidneyinjuryvisfatinIL-6

急性胰腺炎（acutepancreatitis，AP）是临床常见急腹症之一，尤其是急性坏死性胰腺炎(acutenecrotizingpancreatitis，ANP)，病情凶险，常累及胃肠、肝、肺、肾等多个器官，造成多器官功能障碍(multipleorgandysfunctionsyndrome，MODS)甚至多器官功能衰竭(multipleorganfailure，MOF)，病死率高。急性胰腺炎病因复杂，目前各种病因导致胰酶的过度激活释放、炎症介质及细胞因子全身播散、氧化应激损伤、微循环障碍等共同参与了该病变发生发展过程。Visfatin是近年来发现的一种新的脂肪细胞因子，研究表明它不仅具有类胰岛素的活性，还能够促进脂肪的合成与聚集、调节糖代谢，与肥胖、炎症、糖尿病及代谢综合征等相关疾病有关。目前的研究更进一步发现内脂素与COPD、急性肺损伤、炎症性肠病、关节炎等急慢性炎症有密切关系，但在急性胰腺炎方面的研究国内外仍鲜有报道。本研究通过观察胰胆管逆行注射脱氧胆酸钠诱导大鼠急性坏死性胰腺炎（ANP）发病过程中肾脏组内脂素mRNA表达变化，探讨内脂素在ANP并肾损伤中的作用及意义。

1材料与方法

1.1材料（1）实验动物：清洁级健康成年SD大鼠64只，体重250±50g，购自广西医科大学动物实验中心。（2）药物与试剂：TRIzol（Invitrogen公司）；RT-PCRTaq酶（omega公司）；RT-PCR逆转录试剂盒（fermentas公司）；IL-6ELISA试剂盒（武汉博士德生物公司）。

1.2方法

1.2.1分组与造模64只大鼠随机分为2组，假手术对照组（C组，32只），急性坏死性胰腺炎模型组（A组，32只）。每组大鼠术前禁食不禁水12h，用10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉。A组：无菌条件下取上腹正中切口入腹，寻找胆胰管十二指肠乳头开口，将一次性静脉留置套管经乳头部逆行插入胆胰管约1cm，以无损伤夹夹于肝门部阻断胆管后，以0.1ml/min的速度匀速注入1.5％脱氧胆酸钠(1ml/kg)，注毕拔管，以无损伤缝线缝合肠壁穿刺孔处。C组大鼠开腹后仅翻动十二指肠并触摸胰腺数次即关腹。各组大鼠在术后6h、12h、24h、48h按时点分批处死，留取静脉血、胰腺、肾脏组织标本。

1.2.2胰腺及肾脏组织病理将留取的标本用40g/L甲醛固定，石蜡包埋、切片后进行HE染色，由同一病理医师在光镜下每张切片观察5个视野，胰腺病理、肾脏病理评分分别参照Kusske[1]、雷文章[2]评分标准进行评分，取平局值作为该标本评分结果。

1.2.3血清淀粉酶测定分别于各时点分批处死大鼠后留取静脉血，全自动生化分析仪测定血清淀粉酶含量。

1.2.4血清IL-6水平测定按ELISA试剂盒操作说明书检测。

1.2.5肾脏visfatinmRNA水平检测引物采用Primerdesign软件设计，由生工生物公司合成。visfatin-F：5’-CCAGGAGGCCAAAGAAGTGTAC-3’，visfatin-R：5’-CTCCTCTGATAGCCGAAGTCATG-3’，扩增片段长度为353bp。内参照β-actin-F：5’-TGCCCATCTATGAGGGTTAC-3’，β-actin-R：5’-TCTCTTGCTCGAAGTCTAGG。采用TRIzol试剂提取组织总RNA，定量后进行RT-PCR，按试剂盒说明操作。PCR扩增反应体积为25ul，扩增条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min；循环35圈；72℃延伸5min。将产物在琼脂糖凝胶(1.5%)上进行电泳，用凝胶扫描图像分析仪测定各时点visfatin扩增条带的总灰度值，并以visfatin扩增条带与β-actin扩增条带的总灰度值的比值做visfatin含量的相对值。

统计学处理应用SPSS13.0软件包分析，实验数据以均数±标准差(x-±s)表示，多组资料比较用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1胰腺大体观及病理变化

C组各时点胰腺肉眼观无异常，镜下胰腺腺泡结构完整。A组胰腺外观呈暗紫色或灰褐色，充血水肿明显，可见局部出血、坏死灶。腹腔内见淡黄色或血性腹水，部分脏器粘连，可见脂肪皂化斑。镜下见胰腺腺泡水肿，结构不清，可见点片状组织坏死及出血，大量炎性细胞浸润，腺小叶结构紊乱。病变随时间延续呈加重趋势。参照Kusske评分标准，按水肿、炎症、出血、坏死范围及程度分别进行评分，得出各组各时点平均值。各组胰腺评分见表l。

2.2肾脏大体观及病理变化

C组各时点肾脏大体形态未见异常；光镜下，肾皮质、髓质结构正常。A组肾脏体积略增大，在12h后外观呈暗紫色，尤以48h时明显；镜下则可见肾小球淤血，肾小管上皮细胞肿胀，小管结构不清晰，可见细胞脱落换死，炎症细胞浸润，管腔扩大，可见管型，肾脏病理变化随时间延长呈逐渐加重趋势。见表l。

2.3血清淀粉酶及IL-6检测

A组各时点血清淀粉酶及IL-6水平较C组显著升高(P<0.05)，且随时间延长表达量逐渐增加，24h及48小时最高；见表l。

2.4肾脏visfatinmRNA水平

同一时点肾脏visfatinmRNA表达，A组较C组明显增高(P<0.05)，且A组的表达量随时间延长而递增，见图1、表2。

表1各组大鼠胰腺和肾脏病理评分、血清淀粉酶及IL-6含量比较（x-±s，n=8）

图1visfatinmRNA的表达

3讨论

急性肾功能衰竭是SAP常见死亡原因之一，在SAP并发多器官功能损伤中其发生率高达约为14％～43％以上，病死率高，仅次于肺损伤[3-4]。SAP时产生的大量炎性递质和细胞因子是SAP相关性肾损伤的主要原因。SAP早期内毒素、细菌感染等刺激炎症细胞活化，过度释放多种炎症介质和细胞因子，并形成级联放大反应，产生SIRS，这些炎性介质和细胞因子呈网络样交叉反应，互相协同对组织器官造成损伤。本实验观察到ANP大鼠出现肾脏组织损害，并随时点延长，病理损伤逐渐加重，提示SAP早期48小时内肾脏呈进行性损伤。IL-6是急性期反应的主要炎症因子，主要由单核细胞、巨噬细胞和内皮细胞所释放，它对血管内皮细胞及炎细胞具有直接的激活和毒性作用，并可诱导急性期蛋白的合成，催化和放大炎性反应和毒性作用，对组织细胞造成损害。IL-6在AP早期即有变化，其表达水平与AP发生及发展密切相关，是反应SIRS严重程度的指标之一[5]。本研究观察到ANP大鼠血清IL-6水平较对照组明显升高，随着时间延长，血清IL-6水平呈不断升高的趋势，24h达高峰，提示ANP大鼠已发生SIRS，并将引起多个胰外器官损伤。

Visfatin是一种内脏组织高表达的细胞因子，主要表达于内脏脂肪组织，心脏、肝、肺、肾、肌肉组织、胰腺、大脑、胎膜、活化的淋巴细胞、巨噬细胞、骨骼基质细胞均有表达，其不仅具有细胞外促炎因子的作用，亦作为一种细胞内酶参与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）合成补救途径[6]。研究表明，循环中的visfatin水平升高与风湿性疾病、肥胖症、糖尿病、冠心病、急性冠脉综合征、和急性肺损伤等多种疾病过程密切相关[7-9]。内脂素可通过NF-κb途径促进前炎症因子如IL-6和趋化因子的转录，增强机体的炎症反应[10]。Moschen等通过给小鼠体外注射重组的内脂素发现内脂素可显著升高血中IL-6水平，增加小鼠肠IL-6mRNA表达[11]。本实验诱导大鼠ANP模型后，采用RT-PCR方法检测visfatinmRNA表达，发现模型组肾脏visfatin表达较对照组明显升高，随着胰腺病理学和肾脏病理学损伤逐渐加重，肾组织visfatinmRNA呈不断升高的趋势。根据以上研究推测visfatin在ANP合并肾损伤过程中很可能会起到类似于IL-6的促炎作用，其可能与visfatin和IL-6的相互作用进而促进炎症因子的级联放大反应，损害肾脏细胞有关，但具体制止尚待进一步研究与探讨。

参考文献

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广西2011年研究生教育创新计划资助项目（编号:2011105981002M198）