结核杆菌DNA荧光定量PCR检测及与涂片抗酸染色的对比研究

结核杆菌DNA荧光定量PCR检测及与涂片抗酸染色的对比研究

黄琼

（岳阳县疾病预防控制中心湖南岳阳414100）

摘要：目的对比并分析荧光定量PCR检测结核杆菌DNA拷贝数与涂片抗酸染色镜检结果。方法选取2016年1月~2016年12月在我中心确诊的结核病患者150痰样本作为结核组，另选取同期来我中心就诊的无结核表现的其他病例患者的40份痰样本作为对照组，两组分别同期进行荧光定量PCR检测和涂片抗酸染色镜检，对检测结果进行比较分析。结果荧光定量PCR法检测结核杆菌阳性率为72.67%，明显高于抗酸涂片法的26.00%，差异具有统计学意义（P＜0.05）。150例痰样本中，抗酸涂片结果阴性112例，阳性34例，疑似4例。在112例阴性结果中，有40例荧光定量PCR检测为阴性，72例检测为阳性，其中结合杆菌DNA拷贝数以102~103数量级居多；38例阳性（含疑似）结果中，有1例荧光定量PCR检测为阴性，37例检测为阳性，其中结合杆菌DNA拷贝数以103~104数量级居多，结果显示，DNA拷贝数数量级与涂片阳性程度基本呈正相关性。结论对于结核杆菌的检测，采用荧光定量PCR法较涂片抗酸染色法，敏感度更高，特异性更强，且前者检测结核杆菌DNA拷贝数与后者镜检阳性程度具有较好的相关性，两种方法联合使用可为临床诊疗提供可靠的依据。

关键词：结核杆菌；荧光定量PCR；DNA拷贝数；涂片抗酸染色

[Abstract]objectivetocompareandanalyzetheresultsofthetestresultsofthedetectionoftheDNAcopynumberoftuberculosisbacillusinfluorescenceandPCR.SelectionmethodsfromJanuary2016toDecember2016inourcenterdiagnosedTBpatients150sputumsamplesastuberculosisgroup，theotherselectedatthesametimetothecenterofTBshownoothercasesofsputumsamplesascontrolgroup，40patientswithtwogroupsrespectivelyoverthesameperiodwithfluorescentquantitativePCRdetectionandsmearmicroscopyacid-faststain，acomparativeanalysisoftestresults.Resultsthepositiverateoftheccawas72.67%，obviouslyhigherthanthe2600%oftheanti-acidsmearmethod，andthedifferencewasstatisticallysignificant（P<0.05）.In150sputumsamples，antiacidsmearresultswerenegative112，positive34，andsuspected4cases.Ofthe112casesofnegativeresults，40werenegativeand72werepositive，withthebacterialDNAbeingcopiedbetween102and103ordersofmagnitude.38caseswerepositive（suspected）results，therearenegativefor1caseoffluorescencequantitativePCRdetection，testingpositivefor37cases，includingcombinedbacillusDNAcopyof103~104ordersofmagnitude，theresultsshowedthatDNAcopynumberorderofmagnitudeandsmearpositivedegreeofpositivecorrelationbetweenthebasic.Conclusionforthedetectionofmycobacteriumtuberculosis，andusingthefluorescentquantitativePCRmethodwithsmearacidstainingmethod，highersensitivity，specificity，andtheformermicroscopytodetectmycobacteriumtuberculosisDNAcopynumberandthelatterhasgoodcorrelation，positivedegreecombinedtwomethodscanprovidereliablebasisforclinicaldiagnosisandtreatment.

[Keywords]tuberculosisbacillus；FluorescencequantitativePCR；DNAcopynumber；Smearanti-aciddyeing

近年来随着流动人口数量和比例的增加，加上艾滋病的传播率提高，使得临床上结核病的发病率也呈现了逐年上升的趋势，然而结核杆菌的传统检测多采用痰标本直接涂片进行抗酸染色计数，但假阳性率较高，敏感性和特异性较低[1]。随着检测技术的不断进步，PCR技术在结核杆菌的检测上获得了广泛应用和认可[2]，为此本研究特利用荧光定量PCR检测结核杆菌DNA拷贝数与涂片抗酸染色镜检的结果进行对比并分析。现具体报告如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2016年1月~2016年12月在我中心确诊的结核病患者150痰样本作为结核组，其中男89例，女61例，年龄12~58岁，平均（42.2±7.1）岁；另选取同期来我中心就诊的无结核表现的其他病例患者的40份痰样本作为对照组，其中男24例，女16例，均为接受过抗痨治疗。

1.2样本采集

两组患者清早起床痰液1~2口，痰液中注意避免混入唾液，由灭菌样本盒加盖送检。

1.3方法

抗酸染色采用梅里埃诊断产品（上海）有限公司代理销售的染色液，结核杆菌DNA荧光定量PCR检测试剂由中山大学达安基因股份有限公司提供，检测仪器为美国ABI公司生产的7300荧光定量PCR仪。

1.3.1荧光定量PCR检测

向痰液样本中按2~4倍量加入浓度2%的NaOH，持续震荡5min后于室温下静置0.5h，静置期间可振荡3次以使痰液充分液化。取液化的痰液离心处理后弃上清液，加100uLDNA浓缩液，混合均匀后在离心弃上清液，加入20uLDNA浓缩液，给予100℃恒温及离心处理后取3uL进行PCR反应实验，其中反应条件：37℃，180s；93℃，60s；93℃，5s；60℃，40s，40循环次。

1.3.2抗酸染色镜检

将细菌涂片标本经制备涂片、初染、脱色、复染、干燥固定，镜检观察：连续观察300个视野未发现结核分枝杆菌视为抗酸杆菌阴性（－）；连续观察300视野发现1～8条杆菌视为疑似结果（±）；连续观察100视野内发现3条以上杆菌视为抗酸杆菌阳性（+）。以上严格按照实验规程及试剂说明进行操作。

1.4统计学处理

应用SPSSl9.0版软件对本次研究数据进行统计分析，n或%表示计数资料，采用X2检验，以P<0.05为具有统计学意义。

2结果

2.1两种不同方法检测结核杆菌阳性率的比较

结核组结果显示，荧光定量PCR法检测结核杆菌阳性率为72.67%，明显高于抗酸涂片法的26.00%，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

3讨论

结核病的细菌学检查临床公认的结核杆菌检测的“金标准”，是临床发现结核病患者、判断治疗效果、以及疾病控制和评价等的重要依据，也是临床对结核患者进行确诊以及治疗和预后的诊断标准的[3]。但是值得注意的是该操作过程中由于受人为、设备等的干扰因素较为显著，导致误差较大，本研究中对照组就出现了1例阳性，因此其特异性不强；此外该方法对结核杆菌和非结核分枝杆菌的分辨效果不佳，而且对结核分枝杆菌的药物敏感性已无法获知；尤其是“金标准”中要求的细菌培养，在时间上需要4～6周时间，且对培养条件要求较高，失去了早期诊断和疗效判定意义，故临床意义大打折扣，难能满足临床诊疗的需要[4]。

FQ-PCR技术是在常规PCR的基础上利用了荧光探针标记技术，在融合了核酸扩增与光谱技术下，使得探针和待检测基因进行有效的特异性结合；同时该技术实现了操作流程的“全封闭式”，并辅以dUPT一UNG酶防污染体系，有效降低了因产物污染而导致的假阳性[5]。因此本研究结果显示荧光定量PCR法检测结核杆菌阳性率为72.67%，明显高于抗酸涂片法的26.00%；并且表二的结果也显示DNA拷贝数数量级与涂片阳性程度基本呈正相关性，这与林瀛等[6]的研究结果相一致，说明FQ-PCR的定量检测具有较高的准确度[7]。

综上所述，对于结核杆菌的检测，采用荧光定量PCR法较涂片抗酸染色法，敏感度更高，特异性更强，且前者检测结核杆菌DNA拷贝数与后者镜检阳性程度具有较好的相关性，两种方法联合使用可为临床诊疗提供可靠的依据。

参考文献

[1]常新剑，裴秋玲.用三种检测法检测结核分枝杆菌的效果[J].当代医药论丛，2015，13（24）：58-59.

[2]王俊妨，靳颖，牛伟霞，等.荧光定量PCR在脑脊液结核分枝杆菌DNA检测中的应用[J].检验医学，2017，32（2）：135-137.

[3]周稳兰，陆春芬，朱蔚岗，等.荧光定量PCR检测技术在肺结核诊断中的应用[J].江苏医药，2015（23）：2874-2875.

[4]杨振兴，陈威，许敏，等.五种检测方法在结核病诊断中的应用评价[J].中国热带医学，2016，16（10）：1024-1026.

[5]王霖，王辉，李才信，等.荧光定量PCR技术在肺结核诊断中的应用研究[J].中国卫生标准管理，2016，7（11）：169-171.

[6]林瀛，陈小岩，俞训彬.结核分枝杆菌DNA实时定量PCR技术在临床病理诊断中的应用[J].实用检验医师杂志，2015，7（3）：143-147.

[7]陈杏媛，郭琴华.结核杆菌三种实验方法的应用评估[J].实验与检验医学，2016，34（3）：373-374.