麝香保心丸、脉平对腹主动脉狭窄高血压大鼠心肌肥厚的作用

麝香保心丸、脉平对腹主动脉狭窄高血压大鼠心肌肥厚的作用

柳玲1石磊2黄杲1梁绪国2(通讯作者)

柳玲1石磊2黄杲1梁绪国2(通讯作者)

（1山东省烟台白石肛肠医院山东烟台264001）

（2山东省烟台毓璜顶医院山东烟台264000）

【摘要】目的在腹主动脉狭窄高血压大鼠模型上观察了心肌肥厚的变化，并探讨其与多种细胞因子、基质金属蛋白酶、心肌细胞凋亡率、凋亡调控基因表达等多种因素之间的关系及中药麝香保心丸、脉平对心肌肥厚和各种影响因素的作用。方法双抗夹心ELISA法测定MMP-2、MMP-9和IL-6、IL-10；放免法检测TNF-α；流式细胞法测心肌细胞凋亡率和凋亡调控基因表达。结果腹主动脉狭窄6周后，大鼠左室重及室重/体重比值明显增加；同时多种细胞因子、基质金属蛋白酶、心肌细胞凋亡率、凋亡调控基因表达等均发生了相应的变化；麝香保心丸和脉平对心肌肥厚和各种影响因素有较好的治疗和预防作用。结论心肌肥厚可能与多种因素有关；麝香保心丸和脉平对预防和治疗心肌肥厚有一定的作用。

【关键词】心肌肥厚麝香保心丸脉平细胞因子基质金属蛋白酶凋亡

【中图分类号】R965【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）28-0151-02

EffectofShexiangbaoxinwanandMaipingonLeftVentricleinPressure-OverloadedHypertrophyRat

【ABSTRACT】AIM：ToexploretheeffectofShexiangbaoxinwanandMaipingonleftventricleinpressure-overloadedhypertrophyrats.Andalsotherelationshipbetweenleftventricularhypertrophy(LVH)andcytokines,matrixmetalloproteinases,apoptosis,andapoptosisgenes.METHODS:IL-6,IL-10,MMP-2,MMP-9wereevaluatedbyELISAmeans.TNF-alphawasmeasuredwithradioimmunoassays.FlowcytometerwasusedtomeasuretheapoptosisratioandtheexpressionofFas,Bcl-2andBax.RESULTS:6weeksafterabdominalaorticcoarctationoperation,comparedwiththeshamoperatedgroup,theweightoftheleftventricle(0.995±0.320g)andheartweight/bodyweight(0.369±0.149)weresignificantlyincreasedinmoderngroup.AndalsoIL-6(213.56±83.41pg/ml),TNF-α(1.997±0.812ng/ml),MMP-2(72.91±35.59),MMP-9(60.15±26.43),andapoptosisgenes(Fas,Bax,Bcl-2,Bcl-2/Bax)expressionwereincreased；apoptosisratio(9.81±5.03),IL-10(91.07±38.74pg/ml)decreasedcomparedwithshamoperatedgroup.The2groupswithdrugs(SB,MP)decreasedtheincreasingweightofLVandventricularweight/bodyweight;andinhibitedthechangesofinfluencingfactors(IL-6,IL-10,TNF-α,MMP-2,MMP-9,apoptosisratio,apoptosisgenesexpression).CONCLUSION:LVHmightberelatedwithmanyinfluencingfactors.ShexiangbaoxinwanandMaipingmayhavethepositiveimportanceinthetreatmentandpreventionofLVH.

【KEYWORDS】LVHShexiangbaoxinwanMaipingCytokinesMatrixmetalloproteinasesApoptosis

近年来的研究已证实高血压的发病与许多因素有关，进而完善和发展了传统的高血压发生、发展的机制，为彻底地阐明高血压的发病机制、发展和转归机理以及人类最终完全控制高血压奠定了分子生物学机理。但其发生机理以及与心室重构和心肌肥厚的关系尚未完全阐明。本研究采用腹主动脉狭窄大鼠高血压模型，观察了麝香保心丸和脉平对高血压大鼠心肌肥厚的作用及对血清中细胞因子（IL-6、IL-10、TNF-α）、基质金属蛋白酶（MMP-2、MMP-9）水平变化以及大鼠心肌细胞凋亡率和凋亡调控基因（Bcl-2、Fas、Bax）表达的影响。

1材料与方法

1.1动物模型的制备

取健康SD大鼠60只，（雌雄各半，2月龄，体重160～180g）术前禁食12小时，自由饮水。用3%巴比妥钠腹腔注射麻醉后，随机分为腹主动脉狭窄手术组（45只）和假手术组大鼠（15只）。参照文献并对手术方式加以改进，于左肋弓下缘0.5cm、脊柱前0.5cm处行1.5～2.0cm纵切口，逐层分离皮下组织，于左肾后上方分离肾动脉，在左右肾动脉分支之间的腹主动脉下方穿入2.0手术缝线，沿血管走行方向放置针尖磨钝的7号注射针头与腹主动脉一起结扎，这时可触摸到结扎点下方腹主动脉搏动明显减弱，小心拔出针头，腹腔滴入青霉素（40万U/ml）适量，逐层关腹，缝合。术后肌注青霉素10万U。假手术组不结扎腹主动脉，其余同手术组。术后正常饮食，定时观查体征。

1.2实验动物分组和程序

造模7天后，腹主动脉狭窄手术组随机分为3组，即模型对照组（模型组），麝香保心丸组（SB组），脉平组（MP组）。假手术组、模型组每日饮用水10ml/kg灌胃；SB组，SB100mg/kg、MP组，MP60mg/kg。将上述药物溶解于饮用水中，按10ml/kg每日一次胃管灌入，共6周。实验过程中动物均自由饮食。

治疗6周后，禁食12小时，称体重。麻醉后从腹主动脉抽取6ml血液，高速离心后分离出血清，-70℃保存待用。立即摘取大鼠心脏，剪断肺静脉，从肺动脉瓣之上2mm处将肺动脉切断，在心包的脏层转折处剪断主动脉和上、下腔静脉。取出心脏后用0.1mol/L、PH7.4PBS洗涤，滤纸吸干，称重；沿二尖瓣平面分离心房与心室，去右心室，称重。计算大鼠左室重/体重（g/100g）比值。

1.3检测方法

1.3.1双抗夹心ELISA法测定MMP-2、MMP-9和IL-6、IL-10（分别严格按各试剂盒说明书操作）。

1.3.2放免法检测TNF-α：采用液相竞争法，分管加样后充分混匀，4℃放置24h，加入分离剂后充分混匀，室温放置20min，4℃离心3500rpm25min，吸弃上清夜，在自动γ计数器上计算标准曲线和TNF-α浓度。

1.3.3流式细胞法测心肌细胞凋亡率和凋亡调控基因表达用机械法分散心肌组织,收集单细胞悬液,经300目尼龙网过滤离心沉淀2min后,加生理盐水洗涤,再次离心沉淀后,置于70%乙醇中备用。加入碘化丙啶（promideiodine，PI）工作液0.5ml，终浓度为10mg/L，室温避光30min后上机进行流式细胞仪（FACScan型流式细胞仪，美国BD公司生产）检测。

上机前以标准荧光微球调整仪器的变异系数并稳定在2%以内，上机后收集2万个细胞，荧光强度以对数放大，光散射数据存软盘，测试完后在Macintosh650计算机上用CellQuestPlot软件（BD公司提供）分析数据，由HP1200c/PS打印结果。

心肌细胞凋亡及凋亡基因表达量以标记阳性细胞百分率表示：=标记阳性细胞数/受检细胞数×100%-非特异结合细胞%[1]。

1.4主要药品和试剂麝香保心丸（Shexiangbaoxinwan,SB）由上海和黄药业公司提供；脉平原粉（maiping，MP）由甘肃独一味生物制药有限公司提供。MMP-2、MMP-9ELISA检测试剂盒（大连泛邦公司），IL-2、IL-10ELISA检测试剂盒及TNF-α放免试剂盒（北京正泰生物技术公司）。

1.5统计学处理所有数据用x-±s表示,组内数据应用配对t检验,两组间比较采用Student′st检验,以P<0.05为有统计学意义。

2结果

2.1对高血压大鼠左室重量及左室重/体重的影响腹主动脉狭窄后，大鼠左室重量及左室重/体重增加，与假手术组有显著差异；药物组动物增加幅度明显减轻。同时发现手术组大鼠左肾均已明显萎缩，而假手术组则变化不大。

表1.各组大鼠左室重、体重及室重/体重比值比较（x-±s）

注：与假手术组比较，*：P<0.05；与模型组比较，#：P<0.05

3讨论

高血压心肌肥厚是心律失常、心衰和猝死等发生的主要原因之一，故如何控制左室肥厚形成是一个十分重要的课题。由于临床目前检查设备本身应用的局限性，对心肌肥厚变化程度正确的评价仍有赖于动物实验。高血压所致左室肥厚形成过程实质是心室重构的过程，心肌细胞凋亡是形成心室重构过程中的必要前提，并受相关基因的调控[2-3]，其中Bcl-2、Bax和Fas基因对凋亡的调控倍受重视。心肌细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）对维持左室形状起重要作用，ECM成分合成或降解代谢失衡是引起左室扩大及心肌重构的主要因素之一。基质金属蛋白酶（MMPs）通过影响ECM的降解起重要作用，而且近期很多研究成果都证实其在多种心血管事件中扮演重要角色[4]。本实验室在血管内皮细胞和平滑肌细胞的研究中也发现细胞凋亡与Fas和Bcl-2的表达有关，且脉平对凋亡基因和MMPs均有调节作用[5.6]。

近来的研究表明，炎性细胞因子不仅与炎症、冠心病等临床多种疾病有关，而且与高血压、心肌肥厚的发生、发展存在密切的联系。IL-6通过刺激受体复合物的组成成分—一种130KD的信号转导成分在心肌细胞的激活和表达增高，导致心肌细胞肥大而引起心肌肥厚，促使左室重构[8]；同时TNF-α可启动和诱导心肌细胞凋亡，刺激iNOS水平增高，并引起平滑肌细胞增殖；IL-10有对抗IL-6等因子所致平滑肌增殖等作用[7]。我们前期的工作也表明冠心病患者血液细胞因子发生紊乱，应用药物可明显改善紊乱现象[8]。

本研究在腹主动脉结扎的高血压大鼠模型上发现，结扎6周后大鼠左室心肌重量和左室重/体重明显增加，发生了左室重构和心肌肥厚现象；同时，细胞因子IL-6、TNF-α水平升高、IL-10降低；MMP-2、MMP-9值增高；并且凋亡率明显降低，凋亡基因表达及Bcl-2/Bax增加。应用药物各组动物的变化情况较模型组明显减轻，较好地防止了心肌肥厚的发生，SB作用优于MP。说明心肌肥厚与多种细胞因子、基质金属蛋白酶、心肌细胞凋亡率、凋亡调控基因表达等多种因素有密切关系；中药麝香保心丸、脉平对心肌肥厚的作用和作用机理尚有待于进一步研究。

参考文献

[1]左连富.流式细胞术与生物医学.沈阳:辽宁科学技术出版社,1996,213～267.

[2]MattfeldtT,MallG.Growthofcapillariesandmyocardialcellsinthenormalratheart.JMolCellCardiol[J].1997,60:1237～1246.

[3]MaclellanWR,SchneiderMD.Deathbydesignprogrammedcelldeathincardiovascularbiologyanddisease[J].CircRes,1997,81(2):137～144.

[4]AdiguzelE，AhmadPJ,Franco,etal,Collagensintheprogressionandcomplicationofatherosclerosis[J].VascMed,2009,55(1):76～84.

[5]梁绪国、刘利德、张勃，等.脉平对血管紧张素II所致平滑肌细胞基质金属蛋白酶变化的影响,滨州医学院学报2010，33（1）26-29.

[6]刘利德、张勃、梁绪国，等.脉平对离体内皮细胞凋亡及凋亡调控基因的影响滨州医学院学报2010，33（2）99-103.

[7]OrshalJM,KhalilRA.ReducedendothelialNO-cGMP-mediatedvascularrelaxationandhypertensioninIL-6-infusedpregnantrats[J].Hypertens,2004,43(2):434～444.

[8]梁绪国,潘其兴.卡托普利与氯沙坦合用对冠心病患者血液细胞因子的影响[J].中国临床药理学与治疗学杂志,2002;7:159-61.

基金项目资助：山东省科技攻关计划项目（2006GG2202019）；烟台市计划项目（2009155-27）