Ad-PTEN联合PI3K抑制剂对人乳腺癌裸鼠移植瘤的治疗研究

Ad-PTEN联合PI3K抑制剂对人乳腺癌裸鼠移植瘤的治疗研究

祁艳斌1任玉1**时文涛1李国兰1朱之燕1

祁艳斌1任玉1**时文涛1李国兰1朱之燕1姜锦2梅玫1*

（1天津医科大学基础医学研究中心300070；2天津市第一中心医院300192）

【摘要】目的本研究的目的是观察表达PTEN的重组腺病毒（Ad-PTEN）联合PI3K抑制剂LY294002对人乳腺癌细胞株MCF-7裸鼠移植瘤的抑制作用，并初步探讨其作用机制。方法建立MCF-7裸鼠移植瘤动物模型：24只MCF-7细胞株移植成功的裸鼠分为四组，即空病毒载体对照组、DMSO对照组、LY294002用药组、Ad-PTEN与LY294002联合用药组。定期测量裸鼠的体重和肿瘤直径；应用Real-timePCR检测肿瘤细胞中PTEN、PI3K、AKT、NF-KB、CyclingD1、Bcl-2的表达水平。结果相对于对照组和PI3K抑制剂单独用药组，联合用药组对肿瘤生长的抑制作用显著增强（P<0.05），且联合用药组肿瘤组织中PI3K、AKT、NF-KB、CyclingD1、Bcl-2的表达下降（P<0.05），而PTEN的表达升高（P<0.05）。结论Ad-PTEN与PI3K抑制剂的联合用药可以增强对人乳腺癌细胞株MCF-7裸鼠移植瘤的生长抑制作用。

【关键词】乳腺癌裸鼠移植瘤模型PI3K抑制剂Ad-PTEN

【中图分类号】R730.5【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）13-0389-02

乳腺癌是发生在乳房腺上皮组织的恶性肿瘤，是女性最常见的恶性肿瘤，其发病率居女性恶性肿瘤首位，死亡率位于第二位，严重威胁着女性的身心健康[1,2]。乳腺癌的发病机制和生物治疗一直是研究的重点。以往研究显示，PI3K/AKT信号通路与乳腺癌的发生、发展关系密切，参与调控了肿瘤细胞的增殖、转移、侵袭等过程[3]。磷酸酶-张力蛋白（PTEN）是拮抗PI3K/AKT通路及下游信号因子的重要调节蛋白，在乳腺癌中通常低表达。因此，我们想观察联合应用重组腺病毒表达载体Ad-PTEN和PI3K抑制剂LY294002，是否可以更有效的抑制乳腺癌裸鼠移植瘤的增殖，并初步探讨联合用药的作用机制。

一、材料与方法

（一）实验材料

LY294002和二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma公司；Trizol和逆转录试剂盒购自Invitrogen公司；SYBRgreenreactionmix购自罗氏公司；BALB/c裸鼠购自中国医学科学院肿瘤研究所，小鼠为雌性，周龄3-4周，重15-20g；含PTEN的重组腺病毒由天津市神经病学研究所惠赠；MCF-7细胞系为本实验中心保存；DMEM购自Invitrogen公司，胎牛血清购自杭州四季青公司；Real-timePCR引物由Primer3软件设计，在上海英骏公司合成。

（二）实验方法

1.细胞培养

MCF-7细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，37℃、5%CO2培养。

2.动物模型建立

取处于对数生长期浓度为4×107/mL的MCF-7细胞50μL接种于裸鼠的右鼠鼷部，皮下匀速注入。每隔一周重复接种直至肿瘤形成。待移植瘤长至5.0mm3时，在无菌条件下取出，修剪去除脂肪和坏死组织，立即放入无血清培养液中，将瘤体剪碎至约1-2mm大小，接种第二批裸鼠左鼷部皮下组织。裸鼠接种完毕大约2周后，瘤体直径增至约5mm时进行干预治疗。

3.动物分组及瘤体变化观察

体内动物实验分为：（1）DMSO组：注射与LY294002治疗组等体积的DMSO；（2）空载体组：注射Ad-vector和DMSO各10μL；（3）LY294002组：注射LY294002溶液10μL；（4）联合用药组：Ad-PTEN和LY294002溶液各注射10μL。每组各6只裸鼠。各组瘤组织均采用原位多点注射进行治疗，每隔3天进行一次注射。每隔3天用游标卡尺测量一次肿瘤的长径（a）和宽径（b），肿瘤体积的计算公式为：V=(a×b2)/2。计算各组肿瘤体积的平均值，绘制肿瘤生长曲线。

4.Real-TimePCR检测基因表达情况

应用Primer3软件，设计扩增PTEN、AKT、PCNA、CyclingD1、Caspase-3、MMP-2、FAK基因特异性引物。液氮研磨后，用Trizol提取肿瘤组织的总RNA。测定RNA浓度，取1μg应用逆转录试剂盒进行cDNA第一链的合成。以cDNA第一链为模板，在ABI7500荧光实时定量PCR仪上进行扩增。选择GAPDH为内参基因，通过△△Ct法计算基因表达差异。

5.统计学处理

应用SPSS13.0软件进行分析。分析方法采用单因素方差分析；α=0.05。

二、结果

（一）对肿瘤增殖的影响

联合治疗组皮下肿瘤与空载体对照组、DMSO组和LY294002相比，瘤体生长较缓慢。在24天后，各组裸鼠均未死亡；联合用药组的肿瘤体积为（405.12±92.13）mm3，明显小于空载体对照组（2511.36±247.14）mm3、DMSO组（2573.67±250.59）mm3、LY294002单独用药组（1589.01±167.19）mm3。各组间的差异具有统计学意义（P<0.05；见图1）.

三、讨论

目前，对乳腺癌的治疗是根据乳腺癌的生物学行为及临床分期、患者的身体情况，采用以手术为主，联合放疗、化疗、内分泌治疗和免疫生物治疗的综合治疗模式。如首先用于乳腺癌治疗的靶向人类表皮生长因子受体-2（humanepidermalgrowthfactorreceptor-2,HER-2）的单克隆抗体（Herceptin），用单药或联合化疗治疗HER-2过表达的晚期乳腺癌均有明显的临床疗效。

PTEN/PI3K/AKT信号通路也与乳腺癌的形成密切相关。多个生长因子结合并激活酪氨酸激酶受体（RTKs），然后募集ⅠA类PI3Ks直接或通过接头蛋白促进PIP2形成PIP3。丝苏氨酸激酶AKT和PDK1被募集到细胞膜上并通过它们的PH结构域与PIP3结合[4]。在细胞膜上，AKT被PDK1和mTORC2磷酸化而激活，从而进一步活化下游多个与增殖、生存、侵袭相关的信号因子。

LY294002是经典的PI3K抑制剂，已有多项研究证明其能有效抑制体内外肿瘤生长；但LY294002不溶于水且具有细胞毒性，所以在临床应用上受到一定限制。本课题的研究结果显示，Ad-PTEN联合LY294002可以更有效地抑制肿瘤的生长，即Ad-PTEN对LY294002起正向协同作用。联合用药组PI3K/AKT及其下游蛋白NF-KB、Bcl-2、CyclinD表的的下降最为显著，说明了Ad-PTEN对LY294002的协同作用与PI3K/AKT通路密切相关。

PTEN是迄今为止发现的唯一具有双重特异性磷酸酶活性的抑癌基因[5]，能够特异性去除磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸肌醇环3位的磷酸根，可以关闭PI3K/AKT及其下游诸多通路。过量表达的PTEN能特异性地诱导细胞周期依赖性激酶抑制因子p21（Waf1）、p27（KIP1）、p57（KIP2）等的表达，引起G1期到S期的阻滞[6]。研究发现，AKT能直接或间接调节IKK的活性，导致NF-KB的核转位、活化及NF-KB依赖的抑制细胞凋亡基因地转录（如Bcl-2）[7]。PTEN能够负向调控PI3K/AKT进而抑制NF-KB的活性。作为IKK的拮抗剂，PTEN可以减少IKB的降解，抑制NF-KB/IKB复合体的解离，阻止NF-KB的核转位。本研究显示，联合用药组的NF-KB表达量比LY294002单独用药组的表达量更低，提示PTEN发挥了非常重要的作用。

总之，LY294002和Ad-PTEN的联合治疗在抑制乳腺癌细胞增殖侵袭，以及促进乳腺癌细胞凋亡等方面具有相互促进的协同作用，这为乳腺癌基因治疗和小分子抑制剂联合治疗的应用提供了重要的理论依据。多途径结合的靶向治疗手段是未来肿瘤治疗的一个重要方向，值得我们进一步探索。

参考文献

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[2]Smith,R.A.,Cokkinides,V.,Brooks,D.,Saslow,D.,Shah,M.&Brawley,O.W.CancerscreeningintheUnitedStates,2011:AreviewofcurrentAmericanCancerSocietyguidelinesandissuesincancerscreening.CA:acancerjournalforclinicians.2011(61):8-30.

[3]王兵,周上福&蔡风林等.AKT与乳腺癌治疗的研究进展.世界肿瘤杂志.2008(7):65-70.

[4]Engelman,J.A.,Luo,J.&Cantley,L.C.Theevolutionofphosphatidylinositol3-kinasesasregulatorsofgrowthandmetabolism.Naturereviews.Genetics.2006(7):606-619.

[5]Cantley,L.C.&Neel,B.G.Newinsightsintotumorsuppression:PTENsuppressestumorformationbyrestrainingthephosphoinositide3-kinase/AKTpathway.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica.1999(96):4240-4245.

[6]Hu,L.,Zaloudek,C.,Mills,G.B.,Gray,J.&Jaffe,R.B.Invivoandinvitroovariancarcinomagrowthinhibitionbyaphosphatidylinositol3-kinaseinhibitor(LY294002).Clinicalcancerresearch:anofficialjournaloftheAmericanAssociationforCancerResearch.2000(6):880-886.

[7]Krajewski,S.,Krajewska,M.,Turner,B.C.,Pratt,C.,Howard,B.,Zapata,J.M.,Frenkel,V.,Robertson,S.,Ionov,Y.,Yamamoto,H.,Perucho,M.,Takayama,S.&Reed,J.C.Prognosticsignificanceofapoptosisregulatorsinbreastcancer.Endocrine-relatedcancer.1999(6):29-40.

(基金项目：*天津市应用基础及前沿技术研究计划项目10JCYBJC12500，**国家自然科学基金青年基金项目51103107）