玉米中三种真菌毒素检测方法的研究

玉米中三种真菌毒素检测方法的研究

赵应娥

关键词：玉米；真菌毒素；检测

在真菌毒素中玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素B1、呕吐毒素，被称为玉米中三大真菌毒素，这三种真菌毒素对玉米造成的污染最为普遍，同时会对畜禽及人类健康造成一定程度侵扰。基于此，为了使人们在日常生产与生活过程中，所接触的玉米优质安全，针对玉米中三种真菌毒素检测方法的研究显得尤为重要。

一、概述真菌毒素常见检测方法

（一）生物学检测方法

真菌毒素对水生物、微生物、家禽、人类等生物细胞新陈代谢产生消极影响，生物学检测通过细胞新陈代谢情况，找到真菌毒素特点并进行分类，达到真菌病毒检测目的。介于生物学检测方法具有灵敏性相对较差、重复性与特异性等特点，因此在真菌毒素检测领域较为少见，主要用于探索发现新真菌毒素，针对急性毒性作用进行检测，通常情况下不用于定性且定量的真菌毒素检测[1]。

（二）物理化学检测方法

因为不同的真菌毒素具有不同的物理与化学特质，通过检测所得出的化学结构与物理形态千差万别，可将真菌毒素从其他物质中区别出来达到检测目的。伴随当前科学技术飞速发展，物理化学检测方法种类繁多，为提升真菌毒素检测成效奠定基础，其中微柱检测技术、高效薄层层析、纸层析、柱层析、气相色谱法、液相色谱法、薄层色谱法等技术形式均是真菌毒素物理化学检测主要方法。

（三）免疫学检测方法

免疫学检测方法始创于1959年，于我国70年代后期开始研究麦基学检测技术，在80年代用于杂色曲菌检测，发展至今该技术包括酶联免疫吸附实验、免疫层析法、荧光光度法、胶体金技术等，因免疫学检测方法具有反应快、经济、迅速、灵敏度高、简便易操作等优势，因此在真菌毒素检测过程中较为常见[2]。

二、研究玉米中三种真菌毒素检测方法

伴随我国科学技术不断发展，当前玉米中三种真菌毒素检测方法主要为多重PCR法，在优化该体系基础上，建立多重PCR检测方法，为研究玉米中三种真菌毒素检测奠定技术基础，同时进行四个片段的扩增检测，分别为192bp（PKS13）、400bp（aflR）、537bp（β-Tubulin）、658bp（tri5），经多重PCR进行检测扩增，将玉米中存在的真菌毒素DNA充分显现出来，以此为基础研究该真菌技术检测方法应用以下几个方面进行分析：

（一）针对真菌毒素DNA进行普通PCR扩增产毒特异性研究

当PCR扩增复性温度=60℃时，PCR复性温度梯度试验深入开展，可以即快速又便捷的反应黄曲毒DNA，相较于omt、nor来讲aflR具有良好基因扩增成效，可以得出清楚且条带单一的DNA片段[3]。

（二）针对真菌毒素DNA进行普通PCR扩增产毒灵敏性研究

经过当前普通PCR扩增反复实践，其灵敏性检验表明，在真菌毒素DNA扩增过程中，引物具有良好的表现，而0.8ng/μL为nor、aflR基因检测最低值，8ng/μL为omt基因检测最低限度值，4ng/μL为PKS13、Tri5、β-Tubulin基因检测最低限度。Genbank中已知基因序列与玉米中真菌毒素检测结果进行对比，发现aflR基因序列与400bp同源性比率高达100%，而99%为PKS13基因序列与189bp片段同源性比率，98%为β-Tubulin基因序列与537bp片段同源性比率，96%为tri5基因序列与658bp片段同源性比率，通过以上检测分析可知，研究玉米中三种真菌毒素可使用PCR扩增检测技术，针对待检玉米样品DNA检测片段引物设计科学有效，可以通过检测结果直观了解三种真菌毒素在玉米中的状态，进而达到检测目的[4]。

（三）研究玉米中三种真菌毒素毒菌株检测在普通PCR中的反应

通过利用普通PCR扩增玉米中提取真菌DNA进行检测后，可清晰得出三种真菌病毒不同的DNA形式，在不同玉米样品中反应不同的构成，说明这三种真菌在检测玉米中所滋生的位置并不相同，侧面反应PCR扩增检测科学性。

（四）针对玉米中产毒菌进行多种PCR法检测研究

经检测优化，以四重PCR反应体系为玉米中产毒菌检测扩增条件，而扩增检测对象为研究基础条件所规设的四对引物，即192bp（PKS13）、400bp（aflR）、537bp（β-Tubulin）、658bp（tri5），且用于呕吐毒素真菌、玉米赤霉烯酮、产黄曲霉毒素的检测，利用扩增提升目的基因检测成效，其中多重PCR检测扩增程序设定为三个循环状态，将2min、94℃设定为首轮循环预变性检测程序，将30s、94℃设定为中间循环变性扩增检测程序，复性与延伸性检测的设置为60℃/30s和72℃/30s，将末轮循环检测温度控制在72℃，检测时间控制在10min，以4℃作为检测结果保存温度。将检测结果利用QuantityOne软件机进行灰度计算可知，多重PCR体系可以对玉米中三种毒素落实初步检测，可有效分析处于玉米中的真菌毒素成分[5]。

结束语：

综上所述，玉米中三种真菌毒素均对畜禽与人类等生物会造成机体损伤，为避免该不良现象的发生，应通过行之有效的检测技术做好真菌病毒的检测，在生物检测、物理化学检测与免疫学检测基础上，利用PCR检测法可高效研究玉米中真菌毒素成分，在提升检测有效性同时，达到避免玉米中真菌毒素消极侵害的目的。

参考文献：

[1]沈亚琴,魏源,陈志鹏等.锑胁迫下丛枝菌根真菌对玉米生长与锑吸收及抗氧化酶的影响[J].环境科学研究,2017,30(5):712-719.

[2]李成龙,温凯,米铁军等.多重荧光偏振免疫分析同时检测玉米中三种真菌毒素[C].//中国畜牧兽医学会兽医食品卫生学分会第十三次学术交流会论文集.2015:306-306.

[3]李听听.玉米和小麦储藏中真菌多样性及真菌毒素的研究[D].山东农业大学,2015.

[4]伏春燕.玉米中三种真菌毒素检测方法的研究[D].山东农业大学,2014.

[5]房凌旭.一种改进的CTAB法提取真菌DNA[J].赤子,2015(12):198-198.