他克莫司对TGF-β1刺激人肾小管上皮细胞表达血管内皮生长因子的影响

他克莫司对TGF-β1刺激人肾小管上皮细胞表达血管内皮生长因子的影响

于黔闽亚丽赵冬惠

于黔闽亚丽赵冬惠（贵阳市第一医院肾科贵州贵阳550002）

【摘要】目的研究他克莫司（FK506）对转化生长因子-β1(TGF-β1)刺激人肾小管上皮细胞(HKC)表达血管内皮生长因子(VEGF)的影响，以探讨其抗肾小管间质纤维化的机制。方法以体外培养的HKC为研究对象，分为以下4组：①阴性对照组,②TGF-β1（8ng/ml）阳性对照组，③TGF-β1（8ng/ml）加FK506(10、30、60ng/ml)组。应用免疫组化方法检测VEGF蛋白的表达，应用RT-PCR方法检测VEGFmRNA、α-SMAmRNA的转录水平。结果阴性对照组HKC有基础量的VEGF和微量的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达。阳性对照组细胞呈现出长梭形外观，α-SMA与VEGF表达明显上调与阴性对照组有显著差异（P<0.01）。FK506以剂量依赖的方式抑制TGF-β1诱导的α-SMA及VEGF的表达(P<0.05或P<0.01)。结论他克莫司可能是一个很有潜力的抗肾间质纤维化的药物,其机制可能是通过下调TGF-β1诱导的VEGF及α-SMA的表达。

【关键词】他克莫司血管内皮生长因子转分化

肾小管间质纤维化是各种原因引起的肾脏疾病进展至终末期肾衰的共同病理特征而研究表明肾小管上皮-间充质细胞转化（pithelial-mesenchymaltransitionEMT）是肾间质纤维化的主要细胞分子机制之一，肾间质纤维化发生发展的核心环节之一[1]。他克莫司(Tacrolimus,FK506)是1984年从土壤微生物培养基中分离出来的一种新型免疫抑制剂。目前临床主要用于肝移植、肾移植排斥反应等的治疗。近年来其应用领域不断拓展，但FK506对肾小管上皮细胞转分化的作用如何研究甚少。

血管内皮细胞生长因子（ascularendothelialgrowthfactorVEGF）维持血管内皮细胞生存再生及其功能的重要因子[2]，研究发现VEGF可促进体外培养的肾小管上皮细胞蛋白合成对维持其生存可能具有重要意义[3]，国内有学者研究发现VEGF具有抑制EMT的作用[4]。在此基础上，应用FK506是否可以在体外条件下抑制TGF-β1，诱导的EMT以及FK506对TGF-β1诱导的EMT过程中，VEGF表达变化的作用，探讨FK506与VEGF的表达变化及EMT的关系。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验细胞：人类肾小管上皮细胞(HKC)购自中国典型培养物保藏中心。

1.1.2试剂：他克莫司（FK506）(安斯泰来公司惠赠)以二甲基亚砜DMSO溶解过滤配制成10mmol/L的储存液避光-20冰箱保存实验前用培养液稀释成所需浓度；DMEM\F12(Gibico公司,USA)；0.25％胰蛋白酶(Thermo公司)；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG、胎牛血清（FBS）(北京中山公司)；人重组TGF-β1(Peprotech公司，USA)；兔抗人VEGF多克隆抗体(山海天呈公司)；TRIzol购于（Invitrogen公司）；RT-PCR逆转录试剂盒（Formentas公司）；α-SMA引物合成（上海生工）。

1.2方法

1.2.1HKC细胞培养于DMEM\F12,5%胎牛血清、100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素培养基中,于37℃、5%CO2培养箱中孵育,细胞传代采用0.25%胰蛋白酶消化细胞。将细胞按照1×106Cells/孔接种于孔板中，细胞生长至70%～80%,换用无血清培养基同步化24h。以未处理的HKC为阴性对照,以TGFβ1(8ng/ml)处理的HKC为阳性对照，和以同一浓度的8ng/mlTGF-β1加不同浓度的FK506(10、30、60ng/ml)处理细胞。然后每4h在倒置显微镜下观察一次细胞形态。48h后倒置显微镜下拍照×200，收集爬片及细胞分别进行以下实验，所有实验重复3次。

1.2.2细胞免疫组化方法测定各组HKC细胞VEGF蛋白的表达。获得细胞爬片后，以冷PBS洗涤3次;4%多聚甲醛固定20min后吸干,加入PBS水化。0.1%Tritonx-100室温30min;0.3%H2O2室温20min封闭内源性过氧化物酶;5%山羊血清血清室温30min,封闭非特异性抗原;加兔抗人VEGF多克隆抗体(1∶150)4℃过夜。再分别与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗37℃孵育40min,DAB显色3-10min,苏木素复染,常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、树脂封片；用PBS替代一抗做空白对照，显微镜下观察并照相。

1.2.3RT-PCR测定细胞mRNA水平的表达：按Trizol说明书提取细胞中的总RNA，紫外分光光度机对RNA定量，用Oligo(dT)引物进行样品RNA（200ng）的反转录,得到cDNA。α-SMA上游5’-gctcacggaggcacccctgaa-3’下游5’-ctgataggacattgttagcat-3’。Vegf上游5'accatgaactttctgctgtc3′下游5'tcaccgcctcggcttgtcac3′，GAPDH上游5’-caaggtcatccatgacaactttg-3’下游5’-gtccaccaccctgttgctgtag-3’（上海生工）。Real-TimePCR反应体系为:10×PCR缓冲液2.5μl;MgCl2溶液3μl;4xdNTP混合液3μl;Taq聚合酶3u-nits;Sybergreen终浓度0.25×;20μmol/L的PCR特异性上游引物0.5μl;20μmol/L的PCR特异性下游引物0.5μl;cDNA2μl;加水至总体积为25μl。反应体系置于Real-TimePCR仪上。分别反应条件:（1）94℃变性3min;35个PCR循环:94℃变性30s;58℃退火30s;72℃延伸60s。（2）94℃变性3min;35个PCR循环:94℃变性30s;58℃退火30s;72℃延伸45s。60s72延伸。（3）94℃变性3min;30个PCR循环:94℃变性30s;60℃退火30s;72℃延伸45s。60s72延伸。取PCR产物5μl+1μl上样缓冲液在1.0琼脂凝胶电泳100V30min同时加入DNAmarker先在紫外灯下观察如为目标条带且清晰无杂带迅速照相分析应用UVI凝胶成像分析系统UVIsoftUVIbandwindowsapplicationV97.04进行扫描并记录光密度强度以GAPDH扩增产物光密度进行校正数值以两者的光密度比值表示，α-SMA基因的浓度除以GAPDH基因的浓度,即为α-SMA基因校正后的相对含量。VEGF基因的浓度除以GAPDH基因的浓度,即为VEGF基因校正后的相对含量。

1.2.4统计学方法：用SPSS12.0软件对结果中的数据进行统计学处理，所有数据以均数±标准差（x-±s）表示，组间比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA)，两两比较用LSD检验，P<0.01为显著差异，P<0.05为有差异，P>0.05为无显著差异。

2结果

2.1HKC细胞形态的观察：倒置显微镜下观察细胞形态，阴性对照组HKC细胞在6孔细胞培养版中生长6天后，形成融合的单层上皮细胞，呈圆形或椭圆形的铺路石样的形态学特征。加TGF-β1（8ng/ml)培养48h后细胞拉长呈现成纤维细胞样梭形外观，且细胞生长排列紊乱，细胞发生了转分化。同时加入不同剂量的FK506和TGF-β1共同作用组，观察到部分细胞形态维持正常的上皮细胞形态，仍存在部分发生形态改变的细胞，似成纤维细胞样。如图（1）

图1显微镜下各组HKC细胞的形态×200。

Figure.1.ObservationofHKCindifferentgroups(Lightmicroscopy,×200)（A）：未处理的HKC组；（B）：以TGFβ1(8ng/ml)处理的HKC组；（C)：TGF-β1（8ng/ml）加FK50610ng/ml处理HKC组；（D)：TGF-β1（8ng/ml）加FK50630ng/ml处理HKC组；（E）：TGF-β1（8ng/ml）加FK506/60ng/ml处理HKC组。

2.2FK506对α-SMAmRNA表达的影响：阴性对照组少量表达α-SMAmRNA，TGFβ1（8ng/ml）干预48h后，较阴性对照组α-SMAmRNA表达量显著上升(Р<0.01)，不同剂量FK506（10、30、60ng/ml）与TGF-β1（8ng/ml）共同作用的HKC细胞α-SMAmRNA的表达均低于阳性对照组有差异（P<0.05），且随着FK506剂量的增加抑制作用逐渐增强，并呈剂量依赖性（Р<0.05）见图2,表1。

MABCDE

图2RT-PCR测定不同组α-SMA及内对照GAPDH的mRNA表达。

Figure2Theexpressionofα-SMAmRNAindifferentgroups

（M)：Marker；（A)：未处理的HKC组；（B）：以TGFβ1(8ng/ml)处理的HKC组；（C)：TGF-β1（8ng/ml）加FK506/10ng/ml处理HKC组；（D)：TGF-β1（8ng/ml）加FK50630ng/ml处理HKC组；（E）：TGF-β1（8ng/ml）加FK50660ng/ml处理HKC组。

2.3FK506对VEGF表达的影响。

2.3.1细胞免疫组化SP法检测HKC细胞VEGF表达的变化细胞免疫组化的结果，将每张片在×100高倍镜下,顺时针盲法计算15个高倍视野中,阳性细胞百分率=总阳性细胞数/总细胞数,每组实验重复3次。

空白对照组VEGF阳性细胞占总HKC细胞的面积比值7.54％，TGF-β1（8ng/ml）组见大量细胞胞浆中呈棕黄色，为VEGF表达阳性，细胞肥大，排列紊乱，有的细胞明显拉长，呈长梭形。阳性细胞占总HKC细胞的面积比值是23.07%，与阴性对照组和FK506各浓度组差异显著（P<0.01），与TGF-β1（8ng/ml）阳性组比较，加入FK506(10、30、60ng/ml)后，仍有部分细胞肥大、拉长，VEGF阳性细胞数目下降，呈剂量依赖性(Р<0.05)。见图3，表2。

图3各组HKC细胞VEGF的阳性表达×200。

Figure3ProteinexpressionofVEGFindifferentgroups(Lightmicroscopy,×200)

（A)：未处理的HKC组；B）：以TGFβ1(8ng/ml)处理的HKC组；（C)：TGF-β1（8ng/ml）加FK50610ng/ml处理HKC组；（D)：TGF-β1（8ng/ml）加FK506/30ng/ml处理HKC组；（E）：TGF-β1（8ng/ml）加FK506/60ng/ml处理HKC组。

2.3.2RT-PCR定量检测：阴性对照组基础量VEGFmRNA的表达，TGFβ1（8ng/ml）干预48h后，较阴性对照组VEGFmRNA表达量显著上升(Р<0.01)，FK506可以减少TGF-β1诱导的VEGFmRNA表达，且随着FK506剂量的增加抑制作用逐渐增强，并呈剂量依赖性（Р<0.05）见图4表1。

ABCDEM

图4RT-PCR测定不同组VEGF及内对照GAPDH的mRNA表达。

Figture4TheexpressionofVEGFmRNAindifferentgroups

（M)：Marker；（A)：未处理的HKC组；（B）：以TGFβ1(8ng/ml)处理的HKC组；（C)：TGF-β1（8ng/ml）加FK50610ng/ml处理HKC组；（D)：TGF-β1（8ng/ml）加FK50630ng/ml处理HKC组；E）：TGF-β1（8ng/ml）加FK50660ng/ml处理HKC组。

表1FK506对各组细胞α-SMAmRNA、VEGFFmRNA含量的变化（n=3x-±s,%)

Table1TheinfluenceofFK506ontheα-SMAmRNA,VEGFmRNA（n=3x-±s,%)

piog:Pioglitazone.*Р<0.05,comparedwithcontrolgroup;△Р<0.05,comparedwithTGF-βinducedgroup;#P,0.01,comparedwithcontrolgroup

表2FK506对各组细胞VEGF阳性率（%）（x-±s,%)

Table2.TheinfluenceofFK506ontheVEGFprotein（x-±s,%)。

piog:Pioglitazone.*Р<0.05,comparedwithcontrolgroup;△Р<0.05,comparedwithTGF-βinducedgroup;#P<0.01,comparedwithcontrolgroup

(A)：未处理的HKC组；(B）：以TGFβ1(8ng/ml)处理的HKC组；(C)：TGF-β1（8ng/ml）加FK50610ng/ml处理HKC组；(D)：TGF-β1（8ng/ml）加FK50630ng/ml处理HKC组；(E）：TGF-β1（8ng/ml）加FK50660ng/ml处理HKC组。

3讨论

他克莫司(FK506)是日本藤泽集团(Fujisawa)于1984年从土壤真菌的肉汤培养基中提取的一种大环内脂类免疫抑制剂，其药理作用与CSA相似，在防治移植肾的急慢性排斥反应,延缓和逆转其慢性功能减退方面优于CsA。近来少有文献报道，他克莫司既能抑制初始T淋巴细胞的激活，又可抑制已致敏的T淋巴细胞活化与增殖，可显著抑制小管上皮细胞增殖，并可减轻肾间质纤维化[5，6]。

EMT是指各种损伤因素的作用下肾小管上皮细胞逐渐失去原有的上皮细胞特性而获得间质肌成纤维细胞特性，是肾间质纤维化进展的重要机制之一[7，8]。大量研究已证实，TGF-β1是参与肾间质纤维化及肾小球硬化的主要因子[9]。EMT的最早改变就是肾小管上皮细胞表型改变，失去表达细胞角蛋白，钙粘蛋白等上皮细胞的标记抗原，并表达新的细胞表型如α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，这些变化为EMT的发生提供了形态学基础[10]。关于他克莫司对EMT的作用，以前的文献报告极少，近期个别文献报告，FK06能抑制肾小管上皮细胞表型转化和细胞外基质的形成逆转EMT的发生[11]。本研究观察到，他克莫司能以剂量依赖的方式抑制TGF-β1诱导的体外培养的肾小管上皮细胞表达α-SMA(P<0.05)，说明他克莫司具有抑制肾小管EMT的作用。

EMT的进展不仅与肾小球、间质纤维化有关，也与肾血管的病变有关。VEGF是与肾血管病变密切相关的一类细胞因子[12]。在生理状态下，有基础量的VEGF的表达，由肾小球足细胞和肾小管上皮细胞合成分泌，对维持肾血管结构和正常生理功能是必需的[13]。在肾脏纤维化中，TGF-β1与VEGF关系的研究也取得了显著进展。TGF-β1可能通过蛋白激酶C（proteinkinaseCPKC）途径上调近端小管上皮细胞VEGF的表达[14]。增加单核细胞的趋化作用加重平滑肌细胞增生及血管壁增厚，管腔狭窄及闭塞等引起肾血流量减少，使毛细血管袢及PTC数量增加，毛细血管球通透性增加，促进细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)成分在内皮细胞外堆积，导致肾脏纤维化[15]。也有报道尚存在某些不同看法，Ohashi等[16]观察到UUO大鼠成型后随着时间延长肾小管上皮细胞VEGF表达减少，肾间质小血管数目也同时减少，并与肾间质纤维化程度相关。本实验通过免疫组化和RT-PCR的方法，发现他克莫司下调TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞VEGF表达，且最大剂量他克莫司组与阴性对照组无显著差异（P>0.05）。

综上所述，随着肾纤维化形成，α-SMA和VEGF表达增加，他克莫司在体外抑制α-SMA和VEGF的表达，这可能是他克莫司抗肾纤维化的可能分子机制。

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