GC-MS联用检测生物检材中的戊丙酸类药物

GC-MS联用检测生物检材中的戊丙酸类药物

蔡玉刚1李建2

（1.泸州市公安局刑事科学技术研究所四川泸州646000；2.西南医科大学附属中医院四川泸州646000）

摘要：目的建立生物检材中戊丙酸类药物的气相色谱-质谱（GC/MS）检验方法。方法戊丙酸钠、戊丙酸镁在酸性条件下形成戊丙酸，利用戊丙酸易溶于有机溶剂的原理，液液提取然后供气质联用仪检验。结果在生物检材中戊丙酸4ug-500ug/ml范围内与峰面积呈良好线性关系，最低检出限4ug/ml，方法回收率大于70%。结论经过实验验证该方法真实可靠，且灵敏度高，易于操作，能用于生物检材中戊丙酸类药物的检验。

关键词：戊丙酸戊丙酸钠戊丙酸镁生物检材气相色谱-质谱法

DeterminationofvalproicacidinbiologicalsamplesbyGC-MS

Caiyugang1Lijian2

（1.InstituteofCriminalScienceandTechnologyResearchofLuZhouMunicipalPublicSecurityBureau，LuZhou，646000China；

2.TraditionalChineseMedicineHospitalAffiliatedofSouthwestMedicalUniversity，luzhou64600China）

Abstract：ObjectiveTodelelopaGC-MSmethodforthedeterminationofvalproicacidinbiologicalsamples.Methodsthevalproicacidwasformedundertheacidicconditionbysodiumvalproateandmagnesiumvalproate.Themethodwasusedtodeterminethesolubilityofvalproicacidinorganicsolvents.Resultstherewasagoodlinearrelationshipbetweentherangeof4ug-500ug/mlandpeakareainbiologicalsamples，andthelowestdetectionlimitwas4ug/ml.Conclusionthemethodisreliable，sensitiveandeasytooperate.Itcanbeusedforthedeterminationofvalproicacidinbiologicalsamples

Keywords：valproicacidsodiumvalproatemagnesiumvalproatebiologicalsamplesGC-MS

戊丙酸类药物包括[5]：戊丙酸钠和戊丙酸镁等，是不含氮的广谱抗癫痫药。对各型癫痫如对各型小发作、肌阵挛性癫痫、局限性发作、大发作和混合型癫痫均有效。口服吸收快而完全，主要分布在细胞外液，在血中大部分与血浆蛋白结合。多用于其它抗癫痫药无效的各型癫痫病人，尤以小发作为最佳。为原发性大发作和失神小发作的首选药。用于抗癫痫外，还可用于治疗热性惊厥、运动障碍、舞蹈症、卟啉症、精神分裂症、带状疱疹引发的疼痛、肾上腺功能紊乱，以及预防酒精戒断综合征。

戊丙酸类药物系镇定类药物，中毒案例在媒体上鲜有报道。该类药物服用过量，表现为恶心、呕吐、腹泻、畏食等消化道症状，继而出现肌无力，四肢震颤，共济失调，嗜睡，意识模糊或昏迷，肝功能异常，血小板减少，胰腺炎。急性中毒者早期多因呼吸中枢麻痹致窒息性死亡，晚期多因呼吸衰竭，脑水肿或合并肺部感染致死。

戊丙酸类药物口服后在肠内转化为丙戊酸[5]，而延迟吸收。体内的蛋白结合率为80%～94%，分布容积0.13～0.22L/kg，血浆半衰期为5～20h。过量时可延长到30h，因蛋白结合部位饱和，可引起较多的循环游离部分。治疗的血清水平是50～100μg/ml。血清中丙戊酸>500μg/ml在临床上出现嗜睡、反应迟钝；>1000μg/ml出现昏迷和代谢紊乱等急性中毒反应。

目前，国内文献上可查的检验戊丙酸类药物的方法有[5]荧光光度法、化学显色法、电位滴定法、红外吸收法和气相色谱法等。戊丙酸类药物在酸性条件下迅速形成戊丙酸（图1），所以检测检材中的戊丙酸具有可操作性，由于此类药物是不含氮的镇定药物且电负性较低，利用气相色谱-氮磷检测器（GC-NPD）和气相色谱-电子捕获检测器（GC-ECD）灵敏度较低，可能会造成漏检。气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）方法检测具有灵敏度高，检测限低等特点，适用于各种生物检材中戊丙酸的检测。本方法汲取了气相色谱分离效率高，质谱灵敏度高的特点，为戊丙酸类药物中毒案件中戊丙酸检验鉴定提供有效的方法。

图1.戊丙酸结构式

Fig1valproicacidstructure

1仪器与试剂

1.1试剂及标准物质

标准品：戊丙酸，标准品由公安部物证鉴定中心提供。

试剂：乙醇、三氯甲烷、无水硫酸钠、硝酸（以上试剂均为分析纯）。

1.2仪器和设备

安捷伦7890A-5975C气相色谱质谱联用仪（GC/MS）；ThermoTDZ5高速离心机；超声波型号：济南巴克BKA-120B；涡旋振荡仪型号：德国IKA；恒温水浴锅型号：北京永光明医疗仪器有限公司XMTD—4000。

2操作及实验条件[1-4]

2.1操作步骤

2.1.1溶液配制

2.1.1.1配制浓度均为0.1mg/mL的戊丙酸标准溶液乙醇工作液，低温保存，有效期6个月；

2.1.1.2配制4ug/ml戊丙酸标准乙醇醇溶液做为质控，室温保存，有效期3个月；

2.1.1.3配制4ug/ml、10ug/ml、60ug/ml、100ug/ml、300ug/ml、500ug/ml戊丙酸乙醇标准溶液，作为标准曲线工作液；

2.1.1.4配制1mol/L的硝酸溶液，供检材调PH值使用。

2.1.2检材处理

平行取胃内容两份各2克（2ml），分别加入1mol/L的硝酸溶液适量调PH=4，震荡5分钟，然后加入三氯甲烷5毫升，超声波萃取10min，涡旋振荡10min，加入无水硫酸钠适量（去乳化），在10000r/min高速离心条件下离心10min，重复提取两次，合并有机相在35℃水浴锅上浓缩挥至近干，用100ul乙醇定容，供GC/MS检验。

同时取等量空白相似检材2份，1份添加2ug/ml戊丙酸乙醇标准液对照品作质量控制检材，另一份作空白比对检材，与检材平行操作。

2.2试验条件

色谱柱：HP-5MS石英毛细管柱（30m×0.32mm×0.25um）（弱极性或者极性柱）；柱温：100℃（1min）30℃/min280℃（6min）；进样口温度：280℃；接口温度：250℃；载气：高纯氦，流速1mL/min，分流比10：1

检测器：EI，70eV，传输线温度250℃，离子源温度：230℃，四级杆温度200℃，倍增器电压自动调谐，扫描方式：SCAN（线性测试扫描方式为：SIM）扫描范围40-500amu，扫描起始时间（溶剂延迟）3min

3检验

分别取0.1mg/ml戊丙酸标准、2.1.2的检材提取液、空白添加提取液及空白液供气质联用仪（GC/MS）检验，每次进样1ul，各进2次。

4结果

4.1线性关系考察

精密配制戊丙酸标准储备液浓度分别为：4ug/ml、10ug/ml、60ug/ml、100ug/ml、300ug/ml、500ug/ml，分别进行测定。以峰面积（y）为纵坐标，以浓度（x，ug/ml）为横坐标做线性回归，回归方程为：y=3.578x-3.280；r2=0.99991.结果表明，戊丙酸在浓度4-500ug/ml范围内峰面积与浓度呈线性相关，最低检测浓度为4ug/ml，信噪比为4：1。

4.2回收率和精密度实验

取空白人血2ml，加入一定量的戊丙酸，制备成戊丙酸浓度为300ug/ml和500ug/ml的样品，采用2.1.2方法处理后供气质联用检验，结果两种浓度下戊丙酸的回收率分别为74.38%和76.59%。

4.3结果评价

检材提取液均检出与0.1mg/ml戊丙酸标准液保留时间一致的色谱峰（检材提取液保留时间为3.711min，戊丙酸标准液保留时间为3.731min，图2），且质谱特征离子碎片及相对丰度比与戊丙酸标准液一致（戊丙酸的特征离子：m/z73、m/z41、m/z102图3），空白对照样品无干扰。阳性结果可靠。

5讨论

5.1色谱柱的选择：戊丙酸结构中含有-COOH是一类极性较大的物质，选用弱极性柱或者中性柱分离比较好。本文考察了DP-1MS、HP-5MS、HP-INNOWAX和XO-17MS四种色谱柱，试验表明HP-5MS和HP-INNOWAX两种柱子峰形较好，无拖尾现象、分离效果较好。

5.2去乳化剂的选择：在生物检材处理中，液液提取的乳化现象比较普遍，特别是血液提取，有效消除乳化现象是提高回收率的一个重要手段。本文选择无水硫酸钠作为去乳剂效果比较好，既能达到去乳化效果又没有引入污染。

6案例应用

2016年11月20日，XX市XX县公安局接群众报案称：一男子在外出务工的路上出现身体不适，在送医院抢救的过程中死亡。经法医解剖和病理结论，该男子系呼吸衰竭死亡，排除机械性窒息和疾病引起窒息死亡。笔者对常规的农药进行筛查均为阴性，对常见镇定剂进行筛查的过程中检出戊丙酸成分。经查，该男子无癫痫史，侦查人员对死者关系人进行调查，最终锁定一个与其有经济纠纷、有癫痫史的嫌疑人，其为了教训死者，在死者吃的饭菜里加了大量戊丙酸钠。笔者在死者胃内容和心血中均检出戊丙酸成分，为案件侦破提供了证据支持。

参考文献：

[1].GA/T188-1998《中毒检材中安定、利眠宁的定性及定量分析方法》

[2].GA/T189-1998《中毒检材中氯丙嗪、异丙嗪、奋乃静的定性及定量分析方法》

[3].GA/T102-1995《中毒检材中巴比妥类药物的定性定量分析方法》

[4].《中国刑事科学技术大全.毒品和毒物检验》，2003年1月第1版

[5].国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版二部附录III。