内质网应激参与脊髓星形胶质细胞氧葡萄糖血清剥脱/再恢复诱导的凋亡

内质网应激参与脊髓星形胶质细胞氧葡萄糖血清剥脱/再恢复诱导的凋亡

张晨然张爱梁丁亮华张楠

张晨然张爱梁丁亮华张楠

（苏州大学第三附属医院江苏常州213000）

【摘要】目的研究氧葡萄糖血清剥脱/再恢复（oxygen-glucose-serumdeprivation/restoration,OGSD/R）诱导脊髓来源的星形胶质细胞（Astrocyte,Ast）内质网应激相关凋亡机制。方法原代培养大鼠脊髓来源的Ast，并采用免疫细胞化学的方法行鉴定。应用Hoechst33342荧光染色检测细胞的凋亡，应用Western—blotting法检测caspase-12、caspase-3的水平变化。结果caspase-3和caspase-12在OGSD/R诱导的脊髓Ast中活化；在正常未处理的脊髓Ast中cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-12表达非常低，在给予氧葡萄糖血清剥脱（OGSD）后表达明显增加，而给予氧葡萄糖血清再恢复后导致进一步增加。结论OGSD/R能够诱导脊髓来源的星形胶质细胞的凋亡。并发现caspase-3及caspase-12在此过程中活化。表明内质网应激可能参与OGSD/R诱导脊髓来源的星形胶质细胞的凋亡。

【关键词】星形胶质细胞凋亡内质网应激

【中图分类号】R651.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）04-0123-02

有研究表明Ast在脊髓缺血再灌注中保护神经元方面起着重要作用[1]。同时Ast也影响到中枢神经系统损伤后神经元的再生。为了进一步研究Ast在缺血再灌注损伤对神经元保护作用的机制。我们在体外建立氧葡萄糖血清剥脱/再恢复的模型。

内质网应激途径是近年来新发现的一条凋亡途径。适度的内质网应激可以触发非蛋白折叠反应，使PERK磷酸化，进而磷酸化eIF2α，使翻译启动受阻，减少蛋白质合成，减轻内质网负荷，缓解ERS，促细胞存活[2]；而严重的内质网应激，则引起caspase-12等促凋亡基因的激活，从而导致细胞凋亡[3]。

而内质网应激是否参与了OGSD/R诱导的脊髓星形胶质细胞凋亡的过程仍不清楚。本文拟采用分子生物学的方法观察内质网应激相关蛋白是否参与了OGSD/R诱导的脊髓星形胶质细胞凋亡的过程。

材料与方法

一、材料

新生1～3dSD大鼠,由苏州大学动物实验中心提供。相关抗体购自CST公司;细胞计数试剂盒8(CCK-8)购自日本同仁化学研究所。

二、方法

1.Ast的培养与鉴定取新生1～3dSD大鼠脊髓进行Ast原代培养,培养于含10%胎牛血清和100U/ml青链霉素的DMEM高糖培养基中。采用免疫荧光染色对胶质细胞的标志物胶质纤维酸性蛋白进行鉴定,方法参考Black等[4]报道的方法。

2．体外氧葡萄糖血清剥脱/再恢复（OGSD/R）模型的建立行OGSD/R时，我们将正常培养基去除，D-hank′s液洗2次，并将培养板放入缺氧培养缸，缸内充入95%N2和5%CO2的混合气。检测氧浓度，<1%后密闭培养缸，置于37℃培养箱24小时，每4小时重复充气1次，每次20min。氧葡萄糖血清剥脱后再恢复，即将培养基换成正常含葡萄糖血清的培养基中，并将培养皿放入37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。

3.Hoechst染色法检测取对数生长期的培养细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，将10mm×10mm的血盖片置于六孔板细胞培养板底部，每孔按1×105个细胞/ml的密度接种0.5ml细胞悬液。待细胞分组处理后，从培养中取出血盖片，用预冷的PBS清洗3次。细胞用4%多聚甲醛室温下固定20min，用预冷的PBS清洗3次。Hoechst33342染色液，避光染色30分钟后，弃染色液，用PBS洗3遍，每次3分钟；荧光封片剂封片，荧光显微镜观测。应用IPP(ImagePro-Plus)软件分别计数阳性细胞

4.Westernblot法检测蛋白水平的表达按照不同分组对细胞进行处理提取总蛋白,定量后将蛋白样品与加样缓冲液混合,变性后离心取上清液进行蛋白电泳,按常规方法转膜、封闭、孵育抗体、显影,凝胶图像处理系统分析目的条带净光密度值。

三、统计学处理

所有数据均用平均数±标准差（x-±SD)表示，用SPSS13.0软件进行统计学分析。采用单因素方差分析（oneway－ANOVA）方法进行统计学处理，p<0.05/p<0.01被认为具有显著性差异。

结果

一、氧葡萄糖血清剥脱/再恢复（OGSD/R）诱导的星形胶质细胞细胞凋亡的影响

给予OGSD/R后观察脊髓Ast凋亡的情况。我们采用Hochest33342染色，直接从形态学角度观察，发现在正常培养条件下星形胶质细胞几乎无明显凋亡的发生，而给予氧葡萄糖血清剥脱（OGSD）处理后大量脊髓星形胶质细胞发生凋亡。而给予再恢复，在给予再恢复6h时损伤进一步加重，凋亡细胞数目进一步增加。我们的结果显示OGSD/R可以导致脊髓星形胶质细胞凋亡（图.1）。

图.1OGSD/R可诱导脊髓Ast的凋亡。Cont代表对照组，实验组与对照组比较*p<0.05,**p<0.01;实验组与单纯8hOGSD组比较，#p<0.05,##p<0.01。

二、caspase3和caspase12在OGSD/R诱导的脊髓Ast中活化

Caspase-3和caspase12是凋亡过程中最重要的蛋白酶，在正常未处理的脊髓星形胶质细胞中cleaved-caspase-3和cleaved-caspase12表达非常低，在给予氧葡萄糖血清剥脱（OGSD）后，表达明显增加，而给予氧葡萄糖血清再恢复导致表达进一步增加，结果表明，氧葡萄糖血清剥脱/再恢复（OGSD/R）导致脊髓星形胶质细胞发生内质网应激（ERS），并引发ERS所致的凋亡(图.2)。

图.2caspase3和caspase12在OGSD/R诱导的脊髓Ast中活化。实验组与对照组比较*p<0.05,**p<0.01;实验组与单纯8hOGSD组比较，#p<0.05,##p<0.01。

讨论

实验中，我们采用氧葡萄糖血清剥脱/再恢复（OGSD/R）的方法，从体外模拟体内缺血再灌注损伤。我们采用的方法依然有不足之处，这主要缺血再灌注损伤的病理生理过程中除氧气能量耗竭外，还包括血液流变学的变化、炎性反应、PH值的变化等。但是我们所采用的模型依然是体外模拟缺血再灌注损伤的主要方法。该模型能够有效模拟氧能量耗竭的病理过程，且具有简单、可重复性好的特点。

Yu等[5]研究显示氧葡萄糖血清剥脱诱导星形胶质细胞的凋亡和这些细胞的能量代谢水平有关。Jiang等[6]研究显示星形胶质细胞在缺血后发生凋亡，并在缺血4个小时后Erk和Akt发生磷酸化。本实验结果显示，氧葡萄糖血清剥脱/再恢复能够诱导脊髓来源的星形胶质细胞的凋亡，同时PERK/eIF2α通路及caspase-12在此过程中活化，提示内质网应激可能参与了氧葡萄糖血清剥脱/再恢复所诱导脊髓来源的星形胶质细胞凋亡的过程。

Caspase-3被认为是凋亡执行的关键分子，是凋亡过程中最重要的蛋白酶，是多种凋亡途径的共同下游效应部分，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路[7]。在我们的研究中，在正常未处理的脊髓星形胶质细胞中cleaved-caspase-3表达非常低，在给予OGSD后，cleaved-caspase-3的表达明显增加，而给予氧葡萄糖血清再恢复导致cleaved-caspase-3表达进一步增加，与此同时以酶原形式存在的pro-caspase-3逐步减少。表明caspase-3的活化参与了OGSD诱导的脊髓星形胶质细胞的凋亡。

Caspase-12正常是以非活化的procaspase-12形式存在，它位于内质网膜上于GRP78相结合，是介导内质网应激凋亡的关键分子[9]。Mouw等[10]在行大鼠大脑中动脉栓塞后发现caspase-12发生活化，且caspase-12的mRNA表达上调。Aoyama等[11]用酸诱导Ast的凋亡，caspase-12和内质网腔内的GRP78/BIP分离，并被剪切成46KD和35KD的小片段（cleaved-caspase-12）发生活化。在我们的研究中，在给予氧葡萄糖血清剥脱（OGSD）后，cleaved-caspase-12的表达明显增加，而给予氧葡萄糖血清再恢复（restoration），导致cleaved-caspase-12表达进一步增加。这个结果趋势和caspase-3的结果类似。

总之，我们的研究发现氧葡萄糖血清剥脱/再恢复能够诱导脊髓来源的星形胶质细胞的凋亡，同时内质网应激可能参与了氧葡萄糖血清剥脱/再恢复所诱导脊髓来源的星形胶质细胞凋亡的过程。这可能为脊髓缺血再灌注损伤治疗提供了新的治疗靶点。

参考文献

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[2]T.E.Dever,Gene-specificregulationbygeneraltranslationfactors,Cell108(2002)545–556.

[3]T.Nakagawa,H.Zhu,N.Morishima,E.Li,J.Xu,B.A.Yankner,J.Yuan,Caspase-12mediatesendoplasmic-reticulum-specificapoptosisandcytotoxicitybyamyloid-beta,Nature403(2000)98–103.

[4]J.A.Black,H.Sontheimer,S.G.Waxman,Spinalcordastrocytesinvitro:phenotypicpersityandsodiumchannelimmunoreactivity,Glia7(1993)272–285.

[5].A.C.Yu,H.K.Wong,H.W.Yung,L.T.Lau,Ischemia-inducedapoptosisinprimaryculturesofastrocytes,Glia35(2001)121–130.

[6].Z.Jiang,Y.Zhang,X.Q.Chen,P.Y.Lam,H.Yang,Q.Xu,A.C.Yu,ApoptosisandactivationofErkl/2andAktinastrocytespostischemia,NeurochemRes28(2003)831–837.

[7].K.Blomgren,C.Zhu,X.Wang,J.O.Karlsson,A.L.Leverin,B.A.Bahr,C.Mallard,H.Hagberg,Synergisticactivationofcaspase-3bym-calpainafterneonatalhypoxia-ischemia:amechanismof“pathologicalapoptosis”?JBiolChem276(2001)10191–10198.

[8].Mazumder,S.,Plesca,D.andAlmasan,A.,Caspase-3activationisacriticaldeterminantofgenotoxicstress-inducedapoptosis,MethodsMolBiol,414(2008)13-21.

[9].Morishima,N.,Nakanishi,K.,Takenouchi,H.,Shibata,T.andYasuhiko,Y.,Anendoplasmicreticulumstress-specificcaspasecascadeinapoptosis.Cytochromec-independentactivationofcaspase-9bycaspase-12,JBiolChem,277(2002)34287-94.

[10].Mouw,G.,Zechel,J.L.,Gamboa,J.,Lust,W.D.,Selman,W.R.andRatcheson,R.A.,Activationofcaspase-12,anendoplasmicreticulumresidentcaspase,afterpermanentfocalischemiainrat,Neuroreport,14(2003)183-6.

[11].Aoyama,K.,Burns,D.M.,Suh,S.W.,Garnier,P.,Matsumori,Y.,Shiina,H.andSwanson,R.A.,Acidosiscausesendoplasmicreticulumstressandcaspase-12-mediatedastrocytedeath,JCerebBloodFlowMetab,25(2005)358-70.

项目基金编号：CJ20130029