特利加压素和FK409联合应用对活体肝移植小肝综合征的保护性治疗研究

特利加压素和FK409联合应用对活体肝移植小肝综合征的保护性治疗研究

李来邦陈奕明张升宁高杨任刚张春平熊庚

李来邦陈奕明张升宁高杨任刚张春平熊庚马俊

(1昆明医科大学附属甘美医院暨昆明市第一人民医院650000)

【摘要】目的探讨特利加压素和FK409联合应用对鼠40％小体积肝移植小肝综合征的保护性治疗作用及其机制。方法将80只大鼠随机分为特利加压素(terlipressin)治疗组、FK409治疗组、特利加压素和FK409联合治疗组及生理盐水治疗对照组(四组，n=20)。观察比较各组存活率，分别于术后药物治疗后1、4、7和10天各组随机每个时间点血清学检查丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TB)及一氧化氮（NO）水平和半定量RT-PCR分析肝脏组织Egr-1基因mRNA表达变化。结果血清丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TB)、一氧化氮（NO）含量与特利加压素、FK409治疗对小体积肝移植小肝综合征的治疗作用具有相关性，各亚组之间及各组内每个亚组与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，可以作为小体积肝移植小肝综合征治疗效果的评价指标。结论小体积肝移植小肝综合征状态属一过性改变。特利加压素和FK409联合治疗能有效缓解门静脉高灌注状态，可以降低门静脉压力及血流量，能显著提高肝大部切除术后小体积肝存活率，联合治疗方案治疗可有效针对发病环节，获得良好疗效。

【关键词】小肝综合征特利加压素FK409一氧化氮

【中图分类号】R73-35+2【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2014）17-0025-03

前言

小肝综合征(SFSS,small-for-sizesyndrome)是发生在扩大肝切除或部分肝脏移植后的临床综合征。植入肝脏体积过小导致功能上不能满足受体需求而出现术后持续胆汁淤积，肝脏合成功能迁迟恢复，凝血机制紊乱，门静脉高压，严重者会出现顽固性腹水，其发病机制目前还不甚明了，是困扰肝脏外科医生的一大临床难题[1-3]。近年来药物治疗方案均有报道[4]，基于对SFSS发病机制的研究和理解之上的各种尝试，本研究在成功建立的大鼠小体积肝移植术后小肝综合征模型上，分别利用特利加压素（terlipressin）降低门静脉压力[5]、FK409促释放NO以及两种药物联合机制保护性治疗小肝综合征，对小体积肝移植后肝脏Egr-1[6]和血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)及总胆红素(TB)、一氧化氮(NO)水平进行动态观察，评价三种治疗方法的疗效，并初步探讨移植肝损伤的分子机制。

1.材料与方法

1.1.实验动物与分组

健康成年雄性SD大鼠80只，重270-350g,由广东省实验动物中心提供，动物自由摄食饮水，饲养温度21－22℃，湿度40－60％，光照12小时（06:00-18:00）、黑暗12小时（18:00-06:00）。随机选取20只为NS治疗对照组(A组)，剩余60只大鼠按我室方法成功建立40％小体积肝移植动脉化模型，随机分为三组:(1)特利加压素治疗组(B组);(2)FK409治疗组(C组);(3)特利加压素和FK409联合应用治疗组(D组)。给药方案:根据相关文献资料设计给药方案[3]。A组：空白对照组（n=20），未作任何处理。B组：特利加压素组（n=20），受体于门静脉阻断前10min按0.05mg/kg剂量行阴茎背静脉注射给予特利加压素一次C组：FK409组(n=20)，供体于取肝前30min,由阴茎静脉缓慢注射FK409,2mg/kg;受体于移植后,门静脉、肝上肝下、下腔静脉血流开放后立刻由阴茎静脉注射FK409,1mg/kg。D组：特利加压素联合FK409组(n=20，特利加压素和FK409用法同C、D组。每组留5只检测门静脉压力，其余分别于术后1、4、7和10天各组随机每个时间点处死5只取血标本和肝脏标本送检。移植术后将大鼠置于单笼饲养，恢复饮水和进食，饲养环境温度保持在20℃左右，观察大鼠皮毛、眼睛、黄饮食、活动和精神状态。

1.2药品与试剂

特利加压素(深圳翰宇药业股份有限公司)；FK409(南京大治生物科技有限公司)；TrizolRNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司)；逆转录试剂盒、PCR试剂盒(美国Fermentas公司)；血清谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TB)测试剂盒(上海科华公司)；一氧化氮（NO）检测试剂盒（碧云天）；

1.2.1门静脉压力测定

门静脉压力测定24G穿刺针直接穿刺门静脉，连接压力换能器(YP100型压力换能器，成都仪器厂)并与多通道生理信号采集处理系统(RM6240B，成都仪器厂)相连，测定两组受体基础门静脉压力及无肝期门静脉阻断时的压力，并动态监测门静脉开放后1小时内的压力变化，取术后5min、10min、20min、40min、60mins个时间点，采用cmH20作为测量单位。

1.2.2血清谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TB)及一氧化氮（NO）水平检测。

术后1、4、7及10d各取(随机数字表法)5只受体鼠麻醉下由腹腔大血管采集2ml全血，4℃，2500rpm/min离心10min，取上清保存于-80℃冰箱，待标本聚齐后送生化室检测（奥林巴斯全自动生化分析仪AU640全自动生化仪）按常规检测法分析谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TB)。一氧化氮（NO）检测严格按照试剂

操作，按50ul/孔样本，50ulGriessReagentI，50ulGriessReagentII，酶标仪（thermomk3）540nm测定吸光度。

1.3统计方法

参数以均数±标准误（mean±SEM）表示。所有资料均用GraphPadPrism5.0软件，多组比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA）方法进行统计学处理。p<0.05被认为有统计学差异。

2.实验结果

2.1存活率比较

动物无手术死亡。B组、C组和D组动物术后恢复良好,所有动物存活超10d，生存率为100％；A组动物术后1d生存率为90.0%(18/20),4d生存率为65.0％(13/20)，7d生存率为60.0%(12/20),10d生存率为30.0%(6/20)。

2.2血清学检查

ALT和TB均于术后第一天即明显升高，第4天达高峰，药物治疗组以后逐渐降低（图1）,相对于A组，B、C、D组药物治疗后血清NO均有升高，联合治疗组变化更明显。

讨论

由于受传统道德观念和宗教的影响，国内尸体供肝非常稀少，在供肝短缺问题日益突出的今天，活体肝移植的出现部分地缓解了供肝短缺问题[7]。在临床上，出于对供体安全的考虑，多数供者只能提供有限体积移植肝脏，即所谓的小体积移植物(small-for-sizegraft)[8-9]。小肝综合征的发病机制是目前国内外研究的热点和难点。比较一致的观点是供肝体积过小导致的肝细胞数量不足及门静脉高灌注导致的肝脏急性损伤。目前认为肝移植术后小肝综合征的发生主要与下列因素有关:(1)移植物的选择；(2)门静脉压力的控制；(3)肝脏静脉回流的改进；(4)移植物内微循环的改进及炎症基因表达的调控[10-12]。本实验拟通过特利加压素和FK409联合应用探讨防治活体肝移植小肝综合征的方法。特利加压素能有效降低门静脉压力，减少入肝血流，减轻肝窦的机械性损伤；而FK409则可通过NO的促释放作用，发挥ＮＯ的抗血小板集聚和抗中性粒细胞黏附，抗肝细胞凋亡和改善肝窦微循环障碍等的作用，减轻血管内皮细胞损伤，从而减轻很多器官缺血和缺血引起的器官水肿及组织损伤，缩小坏死面积，改善缺血后引起的功能缺损[13-14]。观察俩者的协同作用是否能有效防治活体小体积肝移植术后小肝综合征的发生。实验结果证明采用特利加压素和FK409两种不同作用机制药物的联合使用有针对性地控制活体肝移植早期门静脉升高导致过度灌注和缺血再灌注的双重损伤，使得大大加强治疗效果，从而为有效防治活体肝移植术后小肝综合征提供的新方法和新策略。

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基金资助：云南省科技厅-昆医联合专项