原发性肝癌超声造影定量分析与血管生成标记物的相关性研究

原发性肝癌超声造影定量分析与血管生成标记物的相关性研究

杨思光1徐明2

杨思光1徐明2

1广东省惠州市中大惠亚医院超声科516081；2中山大学附属第一医院超声科510080

【摘要】目的：探讨原发性肝癌超声造影定量分析结果与血管生成标记物的关联。方法：本研究选取原发性肝癌100例，均为2013年1月至2014年12月收治，采用超声造影定量分析，分析定量参数与血管生成标记物的关联。结果：肿瘤的上升时间（risetime，RT）和达峰时间（timetopeak，TTP）早于肝实质，造影剂进入肿瘤的速度快于肝实质，与肿瘤由肝动脉供血，增强后动脉期早期快速强化的性质一致。而平均渡越时间（meantransittime，mTT）、曲线下面积（AUC）和灌注指数（PerfusionIndex，PI）在两者间差异无显著性意义。肿瘤超声造影定量参数AUC与微血管密度（microvesseldensity，MVD）50有相关性，相关系数分别为0.40和0.41。标化后肿瘤超声造影灌注定量参数sPI和sAUC与MVD呈正相关，其中sPI与MVD50的相关性最高，r=0.69（P=0.003）。结论：通过HCC超声造影峰值时间对MVD检测，与肿瘤MVD相关性良好，可作为对肿瘤血流灌注定量评价的依据。

【关键词】原发性肝癌；超声造影定量分析；血管生成标记物；相关性

【中图分类号】R521.1【文献标识码】A【文章编号】1276-7808（2015）-07-352-02

原发性肝细胞肝癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）是我国常见的恶性肿瘤，目前早期诊断、早期治疗仍是提高患者生存率至关重要的因素1。研究表明，HCC患者肿瘤血管生成是机体肿瘤出现增殖、生长的前提。肿瘤内微血管密度（microvesseldensity，MVD）的测定是目前评价肿瘤新生血管的金标准，但MVD测量是一种创伤性检查，难以用于术前或非手术治疗患者的肿瘤评价。本研究利用超声造影定量分析评估HCC患者，探讨定量分析参数与血管生成标记物的关联性，为临床提供一种有应用价值的评价新方法。

1资料与方法

1.1一般临床资料

从2013年1月至2014年12月，选取在我院及中山一院院本部就诊的符合以下纳入标准的HCC患者纳入本研究：⑴HCC病灶经手术切除病理证实；⑵患者能配合超声造影检查；⑶无超声造影检查禁忌症。排除意识障碍无法配合超声造影的患者。共纳入HCC患者100例，男62例，女38例，平均年龄（58.4±7.9）岁，年龄范围35-77岁。

1.2超声造影检查

CEUS检查由以下仪器完成：共67例患者接受PhilipsIU22型彩色多普勒超声诊断仪（PhilipsHealthcare，TheNetherlands）扫描，探头频率2.0–5.0MHz；共33例患者接受ToshibaAplio型彩色多普勒超声诊断仪（Toshiba，Tokyo，Japan）扫描，探头频率1.0–4.0MHz。造影剂采用SonoVue（Bracco公司，意大利）。先按常规对肝脏及病灶行二维灰阶和彩色多普勒超声检查。随后启动超声造影模式先行一次常规CEUS，注入造影剂后观察6min，期间分为动脉期（8～30s）、门静脉期（31～120s）及延迟期（121～360s）。若肝癌病灶有多个，则选取其中一个作为靶结节重点观察，明确结节的一般情况，包括大小、位置、形态、边界。选择指标包括：病灶较大（>1.0cm）、容易观察、不易受呼吸影响等。随后，再行第二次CEUS，嘱患者平静呼吸，探头固定，选择能同时显示病灶最大直径和周围肝实质的定量分析扫查切面，并在CEUS过程中，保持这个扫查切面不变，保存从注入造影剂后至120s的动态图像，便于导入定量分析软件进行定量分析。同一患者每次行CEUS检查时，保持各项造影设置条件一致：探头摆放的位置，病人体位，病灶检查深度、机器各项参数（包括机械指数、增益）等。

1.3定量参数测定

后期，将CEUS动态图像数据导入Imagelab定量软件进行脱机分析，选取感兴趣区（ROI），分别选取病灶ROI（即分析区ROI）和参考区ROI，尽量避开大血管和坏死区，绘制原始的时间-强度曲线（TIC曲线），将造影剂到达肝脏的时间点即TIC曲线开始上升的时间点定义为起始点，以计算各个时间参数。通过TIC曲线提取出定量参数，包括上升时间（risetime，RT）、达峰时间（timetopeak，TTP）、峰值强度（maximumofintensity，IMAX）、曲线下面积（AUC）、ROI面积、平均渡越时间（meantransittime，mTT）、拟合强度（qualityoffit，QOF）等参数。脱机行定量分析时，分析过程保持前后一致，如分析的区域保持前后不变等。为减少误差，测量时进行3次测量，计算其平均值作为最终测量结果。此外，利用Origin软件（OriginLabCorporation，Northampton，USA）计算出AUC，根据针对SonoLiver的专用公式，得出：灌注指数（PerfusionIndex，PI）=AUC/mTT（arbitraryunit）。

1.4免疫组织化学染色及结果分析我院病理科对手术病理标本取材后经福尔马林固定石蜡包埋，并经病理证实为HCC组织块，采用两步法行CD34染色，按照试剂盒说明书步骤进行。

①人工计数MVD：参照Weidner等2的方法判断CD34阳性标记，在显微镜低倍下寻找肿瘤中血管密度最高的5个区域（热点，hotspot），然后在200倍视野下人工计数肿瘤微血管个数，任何黄染的细胞或细胞簇，即使未显示管状结构都计算为一个MVD值，计算均值，记作MVD200。

②计算机计数MVD：采用LeieaDMIRE2显微镜和LeieaCCD照相机DFC420（LeieaMierosystemsImagingsolution，Cambridge，UK）读片，参照Wild等3的方法在100倍和50倍光镜下寻找肿瘤中血管密度最高的5个区域，采用LeicaQwinPlusV3软件截取照片，自动检测、标记图片中染色阳性的区域。获得全图片的染色阳性区域像素点，并计算染色阳性区域占全视野面积的百分比，计算平均数，记作MVD100和MVD50。所有测量照片设置保持一致。

1.5统计学分析

应用SPSS13.0统计分析软件，计量数据采用平均数±标准差表示，计量资料采用t检验，计数资料采用卡方检验，相关分析采用spearman法。P<0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1造影后肝实质均见明显增强，肝内血管和组织对比清晰，病灶与肝实质对比好，能准确地选取ROI，获得的原始TIC呈“单峰状”，有明确的上升支和下降支，拟合优度均高于0.90。肿瘤TIC的RT和TTP早于肝实质，肿瘤TIC的上升支和下降支斜率大于肝实质。

HCC与肝实质的超声造影灌注定量参数比较分别取肿瘤和与肿瘤同深度的肝实质为ROI，对得到的超声造影灌注定量参数进行比较显示，肿瘤的RT和TTP早于肝实质，造影剂进入肿瘤的速度快于肝实质，与肿瘤由肝动脉供血，增强后动脉期早期快速强化的性质一致。而mTT、AUC和PI在两者间差异无显著性意义（见表1）。考虑到由于不同患者循环容积和造影剂推注时间人为误差的影响，对肿瘤超声造影灌注参数进行标化：同深度肝实质的RT（或TTP）-肿瘤的RT（或TTP）；其它参数（mTT、PI和AUC）为肿瘤的灌注定量参数与同深度肝实质相应参数之比。

2.2HCC超声造影灌注参数与MVD的相关性比较MVD200（n=29）、MVD100（n=38）、MVD50（n=33）分别为52.6±24.9个/视野（范围22.0~123.8个/视野），5.7±2.8%（范围1.1~10.1%），3.0±1.5%（范围0.6~4.7%）。（在放大50倍条件下进行计算机读片时，由于切片染色干扰较大，计算机无法准确读片，故3个数据缺失）。肿瘤超声造影定量参数AUC与MVD50有相关性，相关系数分别为0.44和0.46。标化后肿瘤超声造影灌注定量参数sPI和sAUC与MVD呈正相关，其中sPI与MVD50的相关性最高，r=0.69（P=0.003）。

3讨论

恶性肿瘤在机体的转移、侵袭、生长与肿瘤血管生成有密切相关性。应用特异性抗体，肿瘤微血管应用免疫组化技术研究，是对肿瘤组织血管生成反映的金标准。CD34为血管源性肿瘤及干细胞特异性标志物之一4。CD34在HCC中，于肿瘤毛细血管内皮细胞中广泛分布，可对肿瘤极微小新生血管显示。应用抗CD34单克隆抗体实施肿瘤组织免疫组化操作，对MVD测定，是病理学对肝癌微血管定量检查的较为可靠指标。超声检查是临床筛选和随访肝肿瘤的首选影像学方法，新近发展的超声造影则能很好地反映肝肿瘤的血流灌注情况，较好地评价肝肿瘤的血管生成活性，已经成熟地应用在临床鉴别诊断肿瘤和对肝肿瘤非手术治疗（如射频等）的疗效评价和随访监测。本研究运用了人工计算和计算机计算两种方法测得MVD，显示肿瘤灌注定量参数与MVD存在相关性，并与显微镜低倍镜下计算机所得的MVD相关性更高。因为MVD是显微镜下的测值，其放大倍数越低，显示的病灶范围越大，更接近超声定量研究时ROI的范围；另外计算机根据染色的内皮细胞的彩色像素百分比算得的MVD在一定程度上将血管的大小因素也考虑在内，比人工单纯计算血管个数更接近超声灌注定量参数。

肿瘤新生血管经研究示，具如下特点：（1）血管分支紊乱，观察管腔，呈增粗显示，血管网结构存在异常；（2）血管数量增加明显；（3）血管基底子膜缺乏完整性，外周通透性高，间隙大。上述因素均可导致肿瘤血流灌注量增加，此也为超声造影显像在临床病理学方面的基础。SonoVue造影剂为血池造影剂，在低机械指数的造影中，几乎不会破坏到造影剂，其血流动力效应相似与红细胞，进而使血管显像达毛细血管水平。采用CEUS对微血管检测，虽并非是组织学上微血管，可对肿瘤组织需求血供量反映。肿瘤恶性程度表现的越高，生长即越高，血供需求量越多，血管数量在单位体积内即越高，CEUS增强有越明显的表现，增强程度可对肿瘤的MVD反映。应用超声造影定量分析软件及反向脉冲谐波技术，对定量参数测定，可对肿瘤的微血管数量反映。结果示，sPI与MVD有良好相关性（r=0.69，P=0.003）。恶性肿瘤迅速生长，实施超声造影显像，有丰富的血供，检测病理微血管，其密度居较高水平，故在CEUS中，肿瘤组织内有较多的造影剂，与本次研究结果一致。

综上，通过HCC超声造影峰值强度对MVD检测，与肿瘤MVD相关性良好，具有不需要组织标本、可重复检查等优点，为活体判断肿瘤新生血管提供了新方法，可作为对肿瘤血流灌注定量评价的依据，可有望用于临床制定治疗措施、判断疗效和预后。

参考文献：

[1]王知力，唐杰，李俊来，等.肝细胞肝癌超声造影与血管生成的关系.中国医学影像学杂志.2007（02）.

[2]LuJP，WangJ，WangT，WangY，WuWQ，GaoL.MicrovesseldensityofmalignantandbenignhepaticlesionsandMRIevaluation.WorldJGastroenterol.20042004-06-15；10（12）：1730-4.

[3]陈敏华，戴莹，严昆，等.超声造影对肝硬化合并小肝癌的早期诊断价值.中华超声影像学杂志.2005（02）.

[4]王知力，唐杰，李俊来，罗渝昆，安力春，徐建宏.肾细胞癌超声造影与血管生成的相关性研究.中国医学影像技术.2007（02）.惠州市科技计划项目专题编号20140805。