宫颈癌患者与宫颈息肉蛋白质谱的差异分析

宫颈癌患者与宫颈息肉蛋白质谱的差异分析

韩云炜范娟吴敬波韩新平王开正李宗衡唐学清

韩云炜范娟吴敬波韩新平王开正李宗衡唐学清（泸州医学院附属医院肿瘤科四川泸州646000）

【中图分类号】R737．9【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）15-0042-03

【摘要】目的探索宫颈癌患者与宫颈息肉的血清蛋白质谱差异，初步探讨其用于宫颈癌诊断的临床价值。方法收集73例宫颈癌患者和39例宫颈息肉的血清标本，随机分为训练组(56例宫颈癌和20例健康人)与测试组(17例宫颈癌和19例健康对照)。采用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱(SELDI-TOFMS)技术检测所有血清标本的蛋白质谱。用BiomarkerWizard统计软件比较训练组宫颈癌与宫颈息肉对照间的蛋白质谱差异，再用BiomarkerPattern软件筛选出一组差异蛋白构建决策分类树模型以鉴别宫颈癌病例和宫颈息肉病例，最后用测试组对分类模型进行验证。结果宫颈癌患者和对照组血清蛋白指纹图谱共有148个明显表达差异的蛋白峰，筛选质荷比(m／z)为2957、2974、2982、3016、3282、5928、5948、6647、6661的9个蛋白质峰作为标志蛋白(P<0.01)建立人工神经网络诊断模型，利用该模型对宫颈癌癌进行盲法预测，结果表明该诊断模型检测宫颈癌的灵敏度为94．2％，特异度为91.3％。结论宫颈癌与宫颈息肉人群的血清蛋白质谱存在差异，SELDI-TOF-MS技术筛选出的血清差异蛋白有助于宫颈癌的早期鉴别诊断。

【关键词】宫颈肿瘤蛋白质组学表面增强激光解析离子化飞行时间质谱血清诊断

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，在全球女性恶性肿瘤中其发病率仅次于宫颈癌，在发展中国家则居首位。统计数据显示，每年全世界范围内宫颈癌新增病例大约49.3万，死亡病例约27.4万，其中80％分布在发展中国家[1]。我国每年新增宫颈癌病例约13万，占全球宫颈癌病例的1/4以上[2]。随着宫颈癌筛查工作的开展，世界范围内宫颈癌发病率普遍下降，但是卫生条件差和经济落后地区宫颈癌发病率仍高于世界平均水平，同时宫颈癌患者年轻化的趋势不容忽视。目前仍没有理想的肿瘤标志物用于宫颈癌的早期诊断，蛋白质组学研究则使实现宫颈癌早期肿瘤标志物的筛查成为可能[3]。为了探索宫颈癌与宫颈息肉的血清蛋白质谱差异，本研究采用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱(SELDI-TOFMS)技术检测了宫颈癌与宫颈息肉的血清蛋白质谱，比较两组的差异，并筛选差异蛋白构建分类模型，以帮助鉴别宫颈癌患者与。

1对象与方法

1.1研究对象

血清标本在患者入院后未进行任何治疗时采集。来自2010年04月至2011年6月泸州医学院附属医院肿瘤科的宫颈癌患者，均得到病理检查确诊并获得患者的知情同意。共73例，年龄25-78岁，平均年龄46.6岁，中位年龄47岁。中低分化鳞癌46例，高分化鳞癌21例；腺癌6例；临床分期ⅡA期24例，ⅡB期38例ⅢA期11例(FIGO分期）；所有病例均经临床检查排除重要脏器(心、肺、肝、肾等)疾病。宫颈息肉健康对照组39例血清标本来自志愿者(均签知情同意书)，年龄23～68岁，平均年龄为46.1岁，中位年龄45岁。

1.2仪器、软件和试剂

美国Sigma公司提供的尿素、乙酸钠、CHAPS(3-环乙胺-1-丙磺酸)、DTT(二硫代苏糖醇)等，美国Ciphergen公司提供的PBSⅡ/C型蛋白质指纹图谱仪、CM10芯片(弱阳离子交换表面芯片)、蛋白质芯片数据采集软件(Proteinsoftware)。

1.3方法

1.3.1收集处理标本

清晨采集受试者空腹静脉血3ml，30min内放于3000r/min离心5min，将分离的血清转入Eppendof管，再次4℃3000r/min离心5min，血清分装50μl每管，冻存于-80℃冰箱中备用。另取l0份正常人血清各0.5ml进行混合，制成混合对照血清，分装后-80℃保存。

1.3.2制备样品混合液

取96孔细胞培养板，每孔加入10μlU9缓冲液(9MUrea，2％CHAPS，1％DTT)。将冻存血清置于冰上融解后4℃10000r/min离心2min，分出血清加入上述培养板中，每孔5μl，4℃600r/min振荡30min。加入185μl结合缓冲液(50mmol/LNaAC，pH4.0)，立即混匀。

1.3.3上样及洗脱

将弱阳离子交换表面芯片(CM10，美国Cipher.gen公司)装入Bioproeessor，每孔加入200μl结合缓冲液，室温振荡洗涤3次，每次5min。甩掉缓冲液，拍于后再加入200μlHPLC水，洗涤2次，快速倾去，拍干。取出芯片，晾干后点加1μlCHCA，10min后重复一次，晾干后即可上机测量。在不同的CM10芯片上随机选择一个点加入混合对照血清与待测样品按照上述方法进行相同处理，以评价系统误差的大小及数据的重现性。

1.3.4采集数据

利用PBSⅡ/C型蛋白质指纹图谱仪(美国Ci.phergen公司)对结合在CM10芯片表面的血清蛋白质进行检测。带有电荷的蛋白质在加速电场的作用下，不同质荷比的蛋白质在长度一定的真空管中飞行所需的时间不同，蛋白质的质荷比(M/Z)与离子飞行时间的平方成正比。带有正电荷的蛋白质离子束在到达检测器的一瞬间，电子倍增器将产生的瞬时电流(瞬时电流I=Q/t，其中Q为t时刻检测器检测到的电荷数)转换成蛋白质的相对含量。设定优化范围为2000～20000质荷比(m/z)，最高检测分子量为100000m/z，激光强度230，检测灵敏度9。仪器采用Ciphergen公司提供的all-in-one蛋白质标准分子进行校正，设定仪器参数，系统的质量偏差≤0.1％。采用CiphergenProteinchip软件自动采集实验数据并进行降低基线和均一化处理，绘制出蛋白质质谱图，其中纵坐标为蛋白质相对含量，横坐标为蛋白质质荷比。

1.3.5统计学处理

利用CiphergenProteinchip软件对获得的混合对照血清图谱进行分析并计算其差异性，以变异系数(cv)值表示，设定CV<15％时，不同芯片之间的实验误差为可接受范围。采用BiomarkerWizard3.1软件分析患者组和对照组血清蛋白指纹图谱，用方差分析计算不用组相同质荷比的蛋白质含量的P值。设定有意义的蛋白质峰出现频率阀值为10％，分别设定5，2两次信噪比(SIN)过滤。确定蛋白质峰比较时，对初步筛选的蛋白质峰进行方差分析，P<0.0l的蛋白质峰差异具有统计学意义。

1.3.6建立诊断模型采用基于误差反传原理（ErrorBack-propagationAlgorithm）的多层前馈（MLP）神经网络[9]，其输入层、隐含层1、隐含层2、输出层的节点分别设置9、6、4、1。以筛选的差异蛋白峰强度（intensity）作为输入节点，设定训练集宫颈癌癌患者的目标输出值为1，对照的目标输出值为0，训练次数为1000，学习率为0.01，采用反向传播(Back-propagation)算法，建立并存储人工神经网络诊断模型。

1.3.7盲法模型验证

采用双盲的方法，将验证集中结宫颈癌和对照血清蛋白标志物质谱数据输入模型进行仿真计算，设定cut-off值为0.3。当输出值在0.3～1时，归为结宫颈癌，当输出值在0～0.3时，归为宫颈息肉。对模拟计算的结果进行方法学评价。

2结果

2.1试验重复性

为保证试验重复性：①在不同的CMIO芯片上随机选择一个点加入混合对照血清与待测样品进行相同处理，对所得蛋白质谱图进行统计分析，结果CV值为11.5％;②m/z为2045的基质峰(Matricpeak)在每个图谱中均出现，强度大致恒定，对其分析结果CV值为10.8％(<15％)；③将2000m/z以下的峰滤去，避免基质峰可能存在的干扰。

2.2m／z为3016、6647的蛋白质峰

在宫颈癌和良性病变对照组中发现质荷比为3016、6647处两个峰有明显差别，其中在3016峰宫颈癌癌较正常人表达增高，而良性对照较正常人却降低，在6647峰结果相反，宫颈癌癌较正常人表达降低，良性对照表达却增高，差异具有统计学意义。

3讨论

宫颈癌早期缺乏特异的临床症状，大多患者就诊时已到肿瘤中晚期，从很大程度上延误了对宫颈癌的治疗。临床上，以临床征象为依据，以详细的体格检查为基础，辅以内镜检查，X线检查，病理和细胞学检查及其他必要的影像学检查及肿瘤标志物检测，宫颈癌大多可以得到明确的诊断[4].其诊断思路主要集中在症状学特征及形态性改变上，显然这对于诊断治疗结宫颈癌有些滞后。在对高危人群的筛查进行研究的同时[5].主要借助不断发展的新的相关技术，寻找新的诊断途径及思路。分子生物学的发展伴随着许多新技术的出现，使得传统的研究模式发生了极大改变。特别是蛋白组学技术的发展壮大使得从微观整体上研究结宫颈癌成为可能。

以往蛋白质的研究多采用色谱分离纯化、二维电泳、光谱、质谱定量定性等分析化学的研究技术。运用这些手段进行研究所必需的技术条件要求高，仪器昂贵，步骤繁琐，耗时冗长，不适应大规模的筛查和临床检测。近年来，随着分子生物学研究的发展及其检测技术的日趋成熟，基因肿瘤标记物对肿瘤的诊断受到极大关注[6,7]，而蛋白质作为基因表达的最终产物也发生相应改变，并具有特征性[8]。随着SELDI技术的应用发展，通过对结宫颈癌血清蛋白质的研究，有可能发现特异的结宫颈癌诊断的生物学标志[9]。用SELDI-TOF-MS技术将病人和对照组的蛋白图谱进行分析对照，能有效发现和捕获新的特异的疾病相关蛋白及其特征[10]，快速的获得尽可能多的蛋白质组学信息并发现新的肿瘤标志物。SELDI技术的优点是可以从原始的样品中进行捕获、检测与分析，灵敏度高，检测范围广，所需样品体积小，检测简便，整个检测过程一般可以在30min内全部完成，特异性高，同时不会破坏所测定的蛋白质，有可靠的重复性[11,12]。

近年来，国内外相继报道了利用SELDI-TOF-MS技术从血清中筛选宫颈癌癌特异标志物的文章。夏婷等[13]运用SELDI-TOF-MS技术获得91例癌症、15例病变和55例健康者血清蛋白指纹图谱，并进行统计分析，结果发现在相对分子质量为1.5×10-20×10范围内，共检测到122个蛋白峰，其中19个差异峰有统计学意义，分子质量为3977和5807的两个差异蛋白组成诊断模型，灵敏度为97.29％(36/37)，特异度为83.78％(31/7)，因而由上述两个差异蛋白组成的宫颈癌诊断模型有助于区分宫颈癌和健康人群。而罗俊华等[14]利用SELDI-TOF-MS检测宫颈浸润癌患者、宫颈良性病变患者及健康女性血清，得到相关蛋白质组的质谱图，采用相关软件对其蛋白质峰值进行鉴定，用化学计量学模型进行数据处理，结果识别出46种差异蛋白，比较蛋白质组学研究发现，质荷比(m/z)为3888、7763、6631的3种蛋白质，分类准确率为95.9％(140/146)，灵敏度为95.3％(41/43)，特异度为98.1％(101/103)，经双盲验证其诊断灵敏度和特异度分别为90.0％(18/20)和87.5％(35/40)，故这3种蛋白质含量与宫颈癌密切相关，有可能成为宫颈癌诊断的生物标志物。

与这些有关宫颈癌蛋白标志物研究相比较，本研究选取了具有一定癌变趋势的良性宫颈癌病变进行研究，旨在了解宫颈癌良性病变向宫颈癌癌演变过程中的变化，在宫颈癌癌和宫颈癌良性疾病之间存在一些蛋白分子的表达有显著性差异，这些蛋白可能是良性病变向宫颈癌癌发展过程中呈连续变化趋势的蛋白。本研究结果显示了SELDI—TOF—MS技术检测宫颈癌癌血清特异蛋白并建立人工神经网络实验诊断模型为宫颈癌癌的早期诊断提供了一种可行的方法，值得进一步研究与应用。

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