斯钙素-1在肝癌中的表达及其临床意义

斯钙素-1在肝癌中的表达及其临床意义

杨明1，2韩涛2谢晓冬2(通讯作者)

杨明1，2韩涛2谢晓冬2(通讯作者)

(1阜新市细河区四合镇人民医院123000；2沈阳军区总医院110000)

【摘要】目的探讨STC-1与肝癌患者临床病理特征的关系及其对预后判断的指导意义。方法应用RealtimePCR和ELISA等方法从基因水平和蛋白水平对肝癌患者及健康人群进行STC-1表达分析。结果进一步分析发现STC-1表达与AFP等肝癌血清学指标有一定的相关性，且与肝癌的大小、Admenson分期等密切。结论首次发现STC-1在肝癌中高表达，是肝癌潜在的早期诊断预警指标物。

【关键词】STC-1肝癌分子标志物

【中图分类号】R730.5【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2014）09-0132-02

肝细胞肝癌（HCC）居恶性肿瘤发病率第四位，在我国高居恶性肿瘤死亡率的第二位[1]。据WHO统计数据显示近10来年全世界每10位新发肝癌中就有4人发生在中国[2]。

目前尚缺乏一种十分特异的外周血肝癌分子标志物，研究发现人类糖蛋白激素-斯钙素-1（STC-1），有可能成为一种新的外周血肝癌分子标志物。对于STC1的研究，国内文献很少报道。本研究应用RealtimePCR和ELISA法在肝癌患者及健康人群外周血中检测STC-1在基因水平和蛋白水平的表达情况，并进一步分析STC-1mRNA表达水平与肝癌患者临床病理参数及肝癌患者预后的关系。

一、材料与方法

(一)临床资料

2010年7月～2013年1月在沈阳军区总医院进行治疗的62例肝癌患者，治疗前均经病理明确诊断为肝细胞性肝癌，年龄为（28～70）岁，平均（51.72±9.06）岁；10名健康人群作为对照组，年龄为（24～83）岁，平均（48.70±14.32）岁，患者与对照组年龄的比较t=1.28，P=0.33，差异无统计学意义。肝癌患者均为手术之后来我科进行治疗的患者。

(二)血清RNA提取及定量

先将室温调至21℃，淋巴细胞分离液分装保存，使用时使其温度升至室温摇匀后再用，离心机温度为室温，4℃离心机提前预冷，备好3个15ml无菌离心管，2个EP管；采集肝癌患者和健康女性外周血3ml，混匀，4℃不超过4h；在离心管中加入等体积生理盐水对血液进行等倍稀释，混匀，在另一离心管中加入3ml淋巴细胞分离液（以下简称分离液），将处理好的血液用滴管沿管壁缓慢加至分离液面上（关键步骤），1500rpm，离心15min，取出离心管，可见离心管中液体分为四层，第二层液体呈乳白色絮状物，为实验所需部分；收集第二层置入含5ml生理盐水的离心管中，混匀，1500rpm，离心15min，洗涤细胞两次，弃上清，即得所需单个核细胞；进行RNA提取及定量。

（三）RealtimePCR检测

在无RNase的PCR管中加入所需反应体系(TotalRNA2?g,OligoDt1?L,逆转录酶1?L,2XPCRmix10?L,DEPC水补至总体积20?L)，混匀，42℃孵育30min，85℃孵育5min即得20?l的cDNA溶液，保存于-20℃。引物在pubmed网站自行设计，经BLAST验证，由上海Invitrogen公司合成，STC-1上游引物5’-CACACCCACGAGCTGACTTC-3’，下游引物5’-TCTCCCTGGTTATGCACTCTCA-3’；β-actin上游引物，F:5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’下游引物R:5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’，取上述cDNA1?l，上游引物1?l，下游引物1?l与2XSYRBGreen混合，用DEPC水补齐至25?l，轻轻混合，94℃预变性3min，94℃变性30sec，退火30sec，72℃延伸40sec，30至35个循环，72℃终末延伸10min。PCR产物realtimePCR仪分析。

（四）酶联免疫吸附试验（ELISA）

采集肝癌患者和健康女性外周血3ml，2500rpm，离心10min，取上清分装至3个无菌EP管，标记后冻于-20℃备用。进行ELISA实验前先将室温调整到23℃，待测样品和所需试剂放置室温下平衡至少30min，并充分混匀；确定此次实验所需微孔数目，将其放置到配套板架上并标记；按要求用蒸馏水稀释浓缩清洗液，充分混匀备用；将标准品（按浓度梯度）及待测品滴入微孔中，（STC-1：每微孔50μl）；向加有待测品的微孔中滴入生物素标记物，每微孔10μl，在加有标准品及待测品的微孔中滴入酶标记物，每微孔50μl，混匀；微孔板覆膜放至37℃恒温箱孵育，1h后取出，用已备清洗液洗5次，第5次冲洗后甩干微孔内液体，反复拍打充分弃尽微孔内残液（每次冲洗时间间隔为3-5s）；每微孔先滴入底物Ⅰ50μl，再滴入底物Ⅱ50μl，混匀，避光反应15min，然后滴入终止液，每微孔50μl，混匀，使反应终止；30min内进行检测。

（五）统计分析

应用统计软件SPSS18.0对数据进行分析，数据统一用均数±标准差（x-±s）来表示，检验水准α=0.05。

二、结果

（一）STC-1mRNA在肝癌患者血清中高表达

1.与健康人群相比，肝癌患者外周血中的STC-1mRNA表达明显增高，见表1。（P＜0.05）。

表1肝癌患者及对照组STC-1mRNA的表达

三、讨论

寻找肝癌早期诊断的分子标志物，早期发现小肝癌，是目前肝癌研究领域的热点和难点，也是提高肝癌诊疗的有效方法[3]。STC-1作为一种重要的癌基因，其与恶性肿瘤发生发展的关系是最近几年标志物领域研究的热点。本研究通过对肝癌患者及健康人群血清中STC-1mRNA和蛋白水平的分析及对肝癌患者临床资料的深入探究发现，STC-1与肝癌的Admenson分期密切相关，在AdmensonIII期中表达显著高于I期和III期，提示STC-1有望对肝癌的恶性程度判断提供参考，STC-1有可能联合AFP为肝癌的早期预警提供新的手段，继而成为潜在的肝癌血清学分子标志物。但是本研究发现STC-1与肝癌肿块大小、CA199表达等不相关，与文献报道不一致，可能与试验样本较少、实验条件不同等因素有关。

综上所述，STC-1不仅有望成为肝癌早期诊断的标志物，还可能与早期肝癌临床分期密切相关，且结合AFP表达对早期肝癌联合分析将提高早期肝癌的判断效果。总之，SCT-1在肝癌中的表达水平对于早期预警及指导治疗将具有重要价值，有潜在的转化研究价值。

参考文献

[1]龚艺贞综述,黎乐群审校.肝细胞癌流行病学病因研究的新进展.中国医学文摘：肿瘤学.2008.22(1):57-59.

[2]邵家胜,卢洪洲,张永信.肝细胞癌流行病学研究进展.肝脏.2011.16(6):503-505.

[3]张品南,许杨扬,郑园园.肝细胞肝癌发生的相关分子学机制与研究进展.浙江临床医学.2010.12(8):893-895.