浅谈乙型肝炎病毒血清标志物检测结果的质量控制

浅谈乙型肝炎病毒血清标志物检测结果的质量控制

蓝义伦

蓝义伦（广西柳州钢铁集团公司疾病预防控制中心广西柳州545001）

【摘要】在全面质量管理体系中，质量控制是确保实验工作正常进行而在每一次实验过程中必须采取的各种措施，也是实施实验室质量保证的一部分，它表明每一步操作的最终结果可以了解本次实验是否有效，所有试验条件是否正常，以及所有试验结果是否可靠，那么在乙型肝炎病毒血清标志物的检测过程中，要保证乙型肝炎病毒血清标志物的检测质量，使其具有较高的重复性、准确性和各实验室之间的结果有可比性，必须做好如下三个方面的质量控制：（1）实验室中的仪器设备必须定期进行检定，同时做好日常保养工作，保持实验室的环境、设施和设备完好；（2）试剂的准备和正确使用质控品，以确保室间质量控制的开展；（3）在加样、孵育、冼板、显色和测定等环节要严格按标准化操作，做好室内的质量控制。

【关键词】乙型肝炎病毒检测结果质量控制

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）01-0025-02

乙型肝炎病毒（HBV）血清标志物包括：HBsAg和抗-HBs、HBeAg和抗-HBe、抗-HBc，俗称两对半。我国是乙型肝炎的高发区，据调查统计，我国人群HBsAg的检出率达9.8%，HBsAg携带者总人数高达1.2亿左右，现患慢性乙型肝炎病人约为1000万，年感染率为7%，年发病率为158/10万，累计HBV感染人群达60%以上。如此严峻的形势，目前本单位对全公司的在岗其间职业健康体检项目中，对乙型肝炎病毒血清标志物的检测是至关重要的，以便寻找疾病的病因和病原，做好阻断传播途径，保护健康人群，预防乙肝传染病的发生具有重大意义。那么作为一名检验工作者，能提供准确可靠的检验结果是一个从事检验工作的最高宗旨，为了达到这一目的，必须做好乙型肝炎病毒血清标志物检测的质量控制是十分重要的，现本人从以下几方面进行质量控制工作分别叙述(主要针对EL1SA法)如下：

1实验室的环境、设施和设备

1.1作为一个实验室，首先应有充分的空间、良好的照明和空调等设施，这是保证检验人员做好工作的前提。

1.2实验室仪器设备，例如，微量加样器、酶标仪和温度计必须定期进行校准，从而使其保持有足够的准确度和精密度，同时必须制定严格的维护保养措施，通常必须仔细注意仪器极易出现问题的区域。由于光学系统缺乏保养或由于未能清洁空气滤片所致的过热而引起的输出量的变化也会导致测定结果的改变。

2室间质量控制

要做好室间质量控制，首先要确保试剂的质量和正确使用质控品。

2.1试剂是保证乙型肝炎病毒血清标志物检测结果准确性的最关键的环节，故应当使用经国家食品药品监督管理局注册批准的试剂。试剂质量的好坏，直接关系到检验结果的准确性和可靠性。虽然各实验室使用的试剂都是各个生物制品厂生产的成套试剂，但由于各生物制品厂生产的成套试剂灵敏度(有1ng／ml、2ng／ml、5ng／m1)和特异性有所不同，要保证乙型肝炎病毒血清标志物检测结果的准确性，在使用过程中不要经常更换厂家，选择一个信誉较高的厂家(知名厂家所生产的试剂盒是通过严格的检测，经过各实验室长期使用所确认)，无论是重复性，还是准确性都较高，所检测的结果各实验室之间可比性、准确率和可靠性都较高。

2.2质控品，分试剂盒内部对照质控品和外部质控品。试剂盒内部对照质控品即为试剂盒内提供的阳性和阴性对照血清，它用于判断每次实验的有效性，但不能作为外部质控品使用，每一次检测样品时，必须有试剂盒内部对照质控品，而且只能在同批号的试剂盒中使用。外部质控品为非试剂盒组份的，可以直接向检验中心购买，它是为了监控检测的重复性而设置的，包括强阳性、弱阳性和阴性质控血清，也可以只设置一个弱阳性质控，以该试剂盒临界值的2～3倍为宜，它的作用是能判断该批样品检测的有效性，因此，每次实验必须包含外部质控品。当试剂盒内部对照质控品和外部质控品的结果无效时，必须重新试验，以保证检验结果的准确性。

3室内的质量控制要从如下六个方面进行控制

3.1血清（浆）标本的质量好坏对检验结果的准确性至关重要，故在处理和保存方面要考虑以下几个方面：

3.1.1应尽量避免溶血:血红蛋中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以辣根过氧化物酶为标记酶的EL1SA测定中，如血清标本中血红蛋浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与随后加入的HRP底物反应显色。

3.1.2样本的采集及血清分离中要避免细菌污染，一则细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；二则一些细菌内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作为标记的测定方法产生非特异性于扰。

3.1.3血清标本如是以无菌操作分离，则可以在2～8℃以下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。长时间保存样本，应在-70℃以下。

3.1.4冰冻保存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，冻融标本的混匀亦应注意，不要进行剧烈振荡，反复颠倒混匀即可。

3.1.5标本在保存中如出现非细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清液检测。

3.2加样注意从以下几方面进行质量控制

3.2.1加样器加样量的准确与否，直接关系到结果的准确性和可靠性，要保证加样量的准确性，必须要有一个加样准确的加样器，多数实验室使用的是带弹簧的加样器，加样器有一个缺点，使用一定时间，或放置不当，或因生锈，弹簧失去一定弹性，均影响加样量的准确性，所以，每隔一定时间进行校正，以保证加样量的准确性。

3.2.2加样量由于各生物制品厂生产的成套试剂盒均使用滴瓶，但滴瓶的口径各厂家也不太一致，虽然按使用说明书操作，每一滴相当于50ul加样量，但存在一定的误差，并且每个操作人员在滴液过程中，使用的角度不可能完全相同，因此，加样的多少也就不同，检测的结果存在误差也就较大，为保证检验质量及结果的准确性，建议各种试剂(包括阴、阳性血清、酶、底物、显色剂、终止液)加样前，充分混匀后，使用加样器进行加样。

3.2.3加样头(吸头)为了保证乙型肝炎病毒血清标志物检验结果的准确性，建议最好是一次性使用，但现在许多实验室所使用的吸头都不是一次性使用，大多反复多次使用，甚至一些条件差的乡镇医院或个体诊所，为了节约成本，一头多用(即用一个吸头将所有样品加完)。大家知道，一个高滴度的乙肝携带者的血清样本有时稀释成千上万倍后，检测结果仍然显阳性，如果吸头未冲洗干净，则可能造成下次标本出现假阳性结果。特别是一头多用，如果前一个患者是一个高滴度的乙肝携带者，吸头的残留液可能造成以后连续几个样品出现阳性，造成假阳性，使结果失真。如果条件有限，则必须将加样头用消毒液浸泡一定时间，反复冲洗后再煮沸消毒，烘干使用，使假阳性结果降到最低限度。

3.3孵育及显色时间和温度的质量控制严格按说明书进行，孵育及显色时间如果放置不够，将可能造成假阴性结果(主要是低滴度的样本)，孵育温度不能过高、过低，应严格控制在37°C左右。过高，可能造成酶失活；过低，酶结合不充分，均可能造成假阴性结果。显色时间不能过长，一般按说明书要求在15分钟，结果判读须在10分钟内完成。大家知道，底物液和显色剂作用时间过久，因受空气中氧气的氧化作用后，均可能要出现颜色反应，否则，结果难以判断，可能出现假阳性。

3.4洗板

3.4.1在乙型肝炎病毒血清标志物检测过程中，洗板时间、次数是非常重要的一个质量控制环节，在大多数实验室都已使用自动洗板机，在洗板过程中，要防止堵孔：①洗板机内部结晶形成，特别是冬天，因此应经常对洗板机进行内部冲洗；②血浆纤维蛋白形成，在洗板过程中易造成堵孔，洗板前对检测样品进行检查去除。洗板完成后，有时仍有少量残留液，应在滤纸上充分拍干。酶标条放在酶标板上不要过高、过低，避免洗板时吸液针卡板和吸液效果差，以保证检验质量。

3.4.2清洗液浓度的配制应严格按说明书进行操作，不能根据自己的爱好，随意加大或减少配制浓度，洗涤液浓度过高，可能造成假阴性，洗涤液浓度过低，可能造成假阳性。

3.5酶标仪每次使用完成后，加防尘罩，但由于在使用过程中，仪器的静电吸引作用，可使空气中的灰尘吸附在机器上，特别是附着在比色孔上，时间过久灰尘过多，光线不易通过滤光片，影响比色。所以，每隔一定时间要除尘，特别是比色孔。

3.6设置灰区：在我们平时的实验检测过程中，做定性测定的时候，有时会遇到某些样品测得的OD值在Cutoff(临界值)附近区域即称灰区。可通过设定这个范围来确定灰区的大小和判定结果。灰区的大小是一个经验值，设置范围一般根据各地情况而定，一般设定在Cutoff(临界值)附近±10的区域，如果定性结果落在灰区中，可建议过一段时间再来复查，以保证本实验室结果的准确性和可靠性。

综上所述，做好乙型肝炎病毒血清标志物检测结果的质量控制是获得准确结果的核心活动，要做好这项工作，最重要的是必须要了解影响实验室测定质量的实验过程的所有步骤，实验室测定过程中最薄弱的环节将反映实验室整个实验的质量。在临床检验中，临床标本的收集，是很容易出现问题并最终影响测定质量的环节，在以前实验室很少注意这一点，而倾向于关注在实验室内的测定过程。但即使是实验室内的测定，也并不单纯，室内质量控制已覆盖了测定分析前的仪器设备状态、SOP的制定及人员培训和测定分析后评价等各个与质量有关的方面。采用统计学方法对检验进行过程质控，是室内质量控制的中心环节，其伴随着每一次常规检测的始终，决定了当批测定结果的有效性，应根据自身实验室的特点选用适当统计质控方法。室间质量控制作为室内质量控制的补充，在临床检验的质量控制中是一个不可缺少的部分，但同一方法而不同试剂的偏差仍然是不同实验室测定结果间缺乏一致的直接原因，因此，室间质量控制的实施，将有力地促进检验过程的标准化。总之，做好室内质量控制和室间质量控制，是获得乙型肝炎病毒血清标志物准确结果的保障。

参考文献

[1]张桌然.临床微生物学和微生物检验[M].北京：人民卫生出版社，2004：374—379.

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