肺金生方含药血清对A549细胞生长及MMP-2表达的影响

肺金生方含药血清对A549细胞生长及MMP-2表达的影响

庞德湘周楠边至慰

庞德湘周楠边至慰（浙江中医药大学附属第二医院肿瘤科310053）

【摘要】目的探讨肺金生含药血清对体外培养的A549细胞生长及MMP-2表达的影响。方法以肺金生方含药血清作用于体外培养的A549细胞，普通倒置显微镜观察各组细胞的生长特点及形态，MTT法检测细胞活力，ELISA法检测20%肺金生方含药血清对A549细胞MMP-2表达的影响。结果20%肺金生方及环磷酰胺含药血清作用于细胞后，与正常细胞相比形态发生明显改变，明显梭形化，细胞数量减少。肺金生方含药血清作用后OD值与空白组血清作用后OD值相比有差异，其中20%、25%含药血清与空白组相比有显著性差异（P<0.01）,20%肺金生方含药血清组对A549细胞MMP-2表达与空白血清组相比有差异（P<0.01）。结论肺金生方可以抑制体外培养的A549细胞生长，降低A549细胞MMP-2表达水平。

【关键词】肺金生方A549细胞MMP-2

肺金生方由《金匮要略》经典方泽漆汤结合临床经验化裁而成，临床应用于肺癌治疗取得了满意的疗效，为探究其作用机理，现将肺金生方含药血清对A549细胞生长及MMP-2表达的影响介绍如下。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物及瘤株wistar大鼠24只,雄性，体重180～200g。人肺腺癌A549细胞瘤株：购自浙江中医药大学动物实验中心细胞实验室。

1.1.2药物肺金生方由泽漆30g、前胡10g、人参9g、桂枝9g、红豆杉枝8g、蜂房15g、石见穿30g等组成。按《中药药理研究方法学》计算大鼠的等效剂量，大鼠等效剂量相当于临床常规成人剂量的7倍，常规水煎，取煎液浓缩，灭菌后定量分装，置4℃冰箱保存备用。环磷酰胺购自江苏恒瑞制药有限公司。

1.1.3主要试剂及设备RPMI1640(美国GIBCO),胰蛋白酶(美国SIGMA);噻唑蓝(美国SIGMA);二甲基亚砜(北京北化精细化学公司)。人MMP-2ELISA试剂盒购自R&DSystems，高速低温离心机(美国SIGMA);超净工作台(北京半导体设备一厂);CO2恒温孵育箱(法国Jouan)。

1.2实验方法

1.2.1动物分组及给药随机分为空白血清组，肺金生方组，CTX组。每组8只。空白对照组每日予2ml生理盐水灌胃，共7天。肺金生方组每日予2ml中药灌胃，共7天。CTX组每日予稀释后的环磷酰胺药液腹腔注射，每次1ml(75mg/kg)，连续给药7d。

1.2.2含药血清的制备连续给药7天后，禁食禁水12h,按0.3ml/100g剂量腹腔注射水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，离心分离血清后灭活过滤，-56℃冷冻保存。

1.2.3人肺腺癌A549细胞的培养肺癌A549细胞培养在含有体积分数10%胎牛血清、青霉素、链霉素各100U/mL的DMEM培养基中,置37℃饱和湿度含体积分数5%CO2和95%空气的恒温箱中无菌培养。体积分数0.25%胰蛋白酶消化传代。取指数生长期的A549细胞,以1×106/mL细胞接种于10cm培养皿中,细胞长至80%融合时,弃去含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基,Hankps液洗2次,换以新鲜无血清培养基,然后分别加入LPS干预。

1.2.4MTT法检测细胞活力

用胰酶消化细胞,用常规培养基配成细胞悬液种入96孔板，板周的孔不加细胞,防止有边缘效应。留空白孔调零,以只加培养液不加细胞作空白对照。在37℃、5%CO2的培养箱内培养24h后，分别加入10%、15%、20%、25%、30%含药血清和对照血清。每组设4个平行孔，继续培养24h，加入MTT溶液20ul(1mg/ml)继续培养4h，终止培养，弃培养液，加入二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)150ul/孔，振荡，选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度OD值。

1.2.5形态学观察

普通倒置显微镜观察各组细胞的生长特点及形态

1.2.6抑制率测定

抑制率=(空白组平均OD值－给药组OD值)/空白组平均OD值

1.2.7ELISA法检测肺金生方含药血清对A549细胞MMP-2表达的影响取细胞上清液，检测MMP-2浓度，采用MMP-2ELISA试剂盒，检测按说明书进行。

1.2.8统计方法采用SPSS17.0统计软件包，实验数据以x-±S表示，采用t检验。P<0.05为有统计学意义，p<0.01有显著意义

2结果

2.1肺金生方及环磷酰胺含药血清对A549细胞形态的影响

正常细胞贴壁生长，融合成片，细胞呈铺路石放射状排列。活细胞透亮,胞体肥厚,呈梭形或椭圆形,细胞质丰富,胞核呈圆形或椭圆形。肺金生方及环磷酰胺含药血清作用于细胞后，与正常细胞相比形态发生明显改变，明显梭形化，细胞数量减少。见图1：

A：空白血清对照组B：肺金生方20%组C：环磷酰胺20%组

2.2肺金生方及环磷酰胺不同浓度含药血清对A549细胞增殖作用的影响

由表1可以看出，肺金生方含药血清作用后OD值与空白组血清作用后OD值相比有差异，其中20%、25%含药血清与空白组相比有显著性差异（P<0.01），各浓度含药血清作用后OD值有随浓度升高而降低的趋势，表示不同浓度的肺金生方含药血清对A549细胞增殖的影响不同。环磷酰胺含药血清作用后OD值与空白组血清作用后OD值相比有显著差异（P<0.01）。

表1肺金生方及环磷酰胺不同浓度含药血清作用于A549细胞的吸光度值及抑制率（%）（x-±S，n=8）

注：△与空白组比较P<0.05△△与空白组比较P<0.01

2.3肺金生方及环磷酰胺对Lewis细胞和A549细胞E-cad、MMP-2表达的影响

由表2可以看出，20%肺金生方含药血清组对A549细胞MMP-2表达与空白血清组相比有差异（P<0.01），20%环磷酰胺含药血清组对A549细胞MMP-2表达与空白血清组相比有差异（P<0.05），而20%肺金生方含药血清组与20%环磷酰胺含药血清组MMP-2表达有差异（P<0.01）。

表2肺金生方及环磷酰胺对A549细胞MMP-2表达的影响（x-±S，n=8）

组别MMP-2(ug/ml)

空白血清组310.1251±37.9493

20%肺金生方含药血清组176.5508±25.8862△△

20%环磷酰胺含药血清组241.6918±36.9182△

注:△与空白组比较P<0.05△△与空白组比较P<0.01。

3讨论

肺金生方来源于《金匮要略》，全方具有益气化痰、散结祛毒的功效,能达到扶正祛邪的效果。方中以泽漆为君,功专消痰行水;人参通九窍,利大小便,以助泽漆逐水消痰;桂枝、前胡、半夏、生姜温阳化饮,降气消痰。人参、甘草健脾以扶正气,佐黄芩以清泄水饮久留所化之郁热;并结合现代药理学成果加用蜂房、红豆杉散结消肿,共奏补肺散结,化气消痰,止咳平喘之功。值得一提的是,方中对病位脏器的气机调理非常重视,以桂枝温阳开结,气化水液痰浊,配合生姜、半夏、前胡降气消痰,疏理肺脏气机;病期日久,必致正虚,故用人参、甘草大补元气以扶正,补脾气亦补肺脏气也,肿瘤病正气大虚,治当不忘培本,是一大要义;泽漆先煎,可去其毒性,乃护正安胃之举。周少玲[1]等采用化疗加肺金生方加减治疗肺虚痰阻型非小细胞肺癌29例，并与单纯化疗的27例患者做对照观察，发现在局部病灶变化、主要症状改善方面，化疗加肺金生方加减组均优于对照组（P<0.05）。

MTT,化学名为3-(4,5)-2-噻唑-(2,5)-二苯基溴化四氢唑蓝,其有效成分四唑蓝能与活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶作用而被还原为不溶于水的蓝色结晶—甲臢(formazan)并沉淀于细胞中,死亡细胞则无此功能。利用MTT这一特性,经其染色后即可在光镜下直接检测细胞凋亡[2]。

MMPs过度表达在包括肺癌在内的许多恶性肿瘤中均与预后不良有关。目前已鉴定出30多种结构有关联的MMPs，其中分子量为72kDa和92kDa的MMP-2和MMP-9能降解多种胶原、明胶、弹性蛋白和层联蛋白等，在人类很多肿瘤中都有很高的表达和活化，是肺癌中主要的蛋白水解酶[3，4]。肺癌组织中MMP-2及MMP-9表达水平的上调使肺癌细胞具有降解基底膜及细胞外基质的能力，肺癌细胞突破各种屏障的能力增强，侵袭转移能力增强[5]。

本研究证实，肺金生方含药血清可以抑制体外培养的A549细胞的增殖，但最高抑制率仍小于30%，可能与药物浓度、实验误差等有关，具体原因有待进一步研究。同时，肺金生方含药血清可以降低MMP-2的表达水平，这可能是其抑制肿瘤侵袭转移的机理之一，但其具体有效成分及作用点仍需要我们进一步探讨。

参考文献

[1]周少玲,庞德湘.肺金生方治疗肺虚痰阻型非小细胞肺癌29例临床观察.[J].浙江中医杂志.2008,43(6):328-329.

[2]冯春琼,马文丽,宋艳斌,等.细胞凋亡的MTT染色法检测.[J].第一军医大学学报,2002,22(3):262-263.

[3]HerbstRS,YanoS,KuniyasuH,etal.DifferentialexpressionofE-cadherinandtypeIVcollagenasegenespredictsoutcomeinpatientswithstageInonsmallcelllungcarcinoma.ClinCancerRes,2000,6(3):790-797.

[4]Martinella-CatusseC,NawrockiB,GillesC,etal.Matrixmetalloproteinasesinbronchopulmonarycarcinomas.HistolHistopathol,1999,14(3):839-843.

[5]LuHJ,GuoCB,JinXQ,etal.Theroleofmatrixmetalloproteinaseexpressioninlungcancermetastasis.ChinClinOncol,2006,11(7):486-490.[陆海军,郭春宝,金先庆,等.基质金属蛋白酶在肺癌转移中作用的研究.临床肿瘤学杂志,2006,11(7):486-490.