顺铂增强抗人DR5单克隆抗体对白血病U937细胞的凋亡作用

顺铂增强抗人DR5单克隆抗体对白血病U937细胞的凋亡作用

丁春生1王靖2

丁春生1王靖2

（1河南大学消化病研究所河南开封475001；2河南大学第一附属医院河南开封475001）

【中图分类号】R733.7【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2010)30-0027-02

【摘要】通过探讨鼠抗人DR5单克隆抗体(mDRA-6)与顺铂(DDP)联合应用对白血病细胞U937凋亡作用的影响，得出结论：抗人DR5单克隆抗体mDRA-6与DDP对U937细胞具有显著的协同杀伤作用。

【关键词】DR5单克隆抗体顺铂白血病细胞凋亡

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）是TNF超家族成员，能够诱导多数肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞无影响[1,2]，被誉为最有前景的抗肿瘤药物。但TRAIL的肝毒性限制了其临床应用。TRAIL受体的单克隆抗体能够模拟TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡，且对肝细胞无毒性作用，此类功能性抗体具有广泛的抗肿瘤应用前景。本实验通过观察抗TRAIL受体DR5的单克隆抗体mDRA-6与低毒剂量顺铂(DDP)联用对白血病细胞U937的凋亡诱导作用，以确定DDP与mDRA-6联合应用是否具有协同效应。

1材料与方法

1.1材料鼠抗人DR5功能性单克隆抗体mDRA-6由河南大学医学院免疫学教研室制备(利用亲和层析方法纯化)。U937细胞购于中国医学科学院上海细胞生物研究所。RPMIMedium1640、四氮唑蓝（MTT）、DMSO购于GIBCO公司；倒置显微镜；数码相机（spot）为Nikon公司产品；全自动酶标仪为Thermolabsystems公司产品。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养U937细胞培养于含10％FBS的RPMI1640培养基中，常规加入青霉素(105U/L)与链霉素(100mg/L)，于37℃，5%CO2培养箱中培养,培养至对数生长期用于实验。

1.2.2MTT法检测mDRA-6及联合DDP对U937细胞的毒性作用

取对数生长期U937细胞制备成细胞悬液，每孔加100μl的U937细胞悬液(3×104/孔)至96孔细胞培养板中。随机分为三组，DDP组加入终浓度分别为0.2、0.39、0.78、1.52、3.13、6.25、12.5、25、50μg/ml的DDP，mDRA-6组加入终浓度分别为0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.25、2.5、5、10μg/ml的mDRA-6，联合组加入10μg/ml的DDP及上述浓度的mDRA-6。同时设空白和阴性对照。每孔终体积200μl，置37℃，50ml/LCO2培养箱内培养12h。离心，更换培养液，加入MTT(5mg/L)工液20μl/孔，继续培养4h。离心，小心吸出上清，每孔加入150μlDMSO，振荡混匀，用全自动酶标仪在波长570nm下测OD吸收值。每一浓度设3个复孔，实验重复3次。计算细胞抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.3凋亡细胞形态观察细胞同上分组及处理12h后用，倒置显微镜照相，记录细胞形态学变化。

1.2.4DNA片段梯度分析调整U937细胞数为1×107/瓶，分别加DDP,mDRA-6及mDRA-6+DDP，mDRA-6终浓度为5μg/ml，DDP终浓度为10μg/ml,置培养箱内培养4h。收集细胞,800rpm离心5min,弃上清，TBS洗1次，加蛋白酶K、RNase及DNA提取液，提取细胞DNA,进行1%琼脂糖凝胶电泳,EB(终浓度为0.5mg/L)染色1h,水脱色1小时,紫外下观察电泳条带并拍照。

1.3统计学方法实验数据用χ-±s表示，组间比较采用t检验。

2结果

mDRA-6浓度

图110μg/mlDDP与不同浓度mDRA-6联合对U937细胞生长抑制曲线

2.1mDRA-6、DDP对U937细胞的生长抑制作用DDP对U937细胞具有杀伤作用，并呈明显的剂量依赖性，1.25μg/ml的mDRA-6与12.5μg/mlDDP分别作用U937细胞12h，细胞死亡率分别为15.12%和17.72%；1.25μg/ml的mDRA-6联合10μg/ml的DDP，U937细胞死亡率增至59.02%。

2.2凋亡细胞形态药物作用12h后,各组U937细胞变长,膜鼓起并逐渐脱离细胞,细胞核固缩呈凝块状,并沿核膜边缘聚集,碎裂呈大小不等的圆滴状小体,形成凋亡小体,且联合组变化较其他两组为著。

2.3DNA琼脂糖凝胶电泳mDRA-6作用U937细胞12h后,琼脂糖凝胶电泳显示梯状DNA带型；mDRA-6与DDP联合作用12h，电泳显示DNA梯状带型更加明显；而DDP单独作用U937细胞12h，未见DNA梯状带型出现。

3讨论

TRAIL及其受体在肿瘤监视中发挥着重要作用,其对绝大多数人肿瘤细胞具有凋亡诱导作用,是近几年肿瘤生物治疗的热点之一。但研究发现某些重组型TRAIL对正常肝细胞有毒性，一定程度上限制了TRAIL的应用。最近有研究表明，抗TRAIL死亡受体的功能性单克隆抗体具有诱导细胞凋亡活性，而对正常肝细胞无毒性作用，因此有可能成为TRAIL的有效替代品。

mDRA-6是抗TRAIL死亡受体5的单克隆抗体，体外可以诱导多种肿瘤细胞凋亡。DDP是一类烷化剂的金属铂类化合物，为临床常用的化疗药物，其作用于DNA形成DDP-DNA复合物，从而干扰DNA复制。实验证实mDRA-6与TRAIL一样主要通过启动死亡受体途径诱导凋亡，与通过DNA损伤诱导凋亡的方案联合时表现出放大的凋亡效应。本研究以单独或联合使用mDRA-6及化疗药物DDP处理U937细胞。在实验中我们发现肿瘤细胞对mDRA-6的敏感性存在差异，U937细胞对mDRA-6中度敏感，12.5μg/ml的DDP作用U937细胞12h，细胞死亡率为17.72%，但与mDRA-6联用后，细胞死亡率增至59.02%；且不同浓度的mDRA-6与DDP联用后均可显著提高U937细胞死亡率（P<0.01），提示DDP可增强抗DR5单抗对U937细胞杀伤作用，结果显示,DDP与mDRA-6联合具有协同作用。应用mDRA-6组可降低化疗药物DDP的使用剂量，增加U937细胞对DDP的敏感性，使用亚细胞毒剂量的DDP即可显著抑制肿瘤细胞生长，降低了化疗药物非特异性的毒性、并可延缓耐药性的产生，这一结果为白血病的临床治疗提供了新的思路。

参考文献

[1]ChuntharapaiA,DodgeK,GrimmerK,etal.Isotype-dependentinhi-bitionoftumorgrowthinvivobymonoclonalantibodiestodeathreceptor4.JImmunol,2001,166(8):4891-4898.

[2]IchikawaK,LiuW,ZhaoL,etal.Tumoricidalactivityofanovelanti-humanDR5monoclonalantibodywithouthepatocytecytotoxicity.NatMed,2001,7(8):954-960.