缬沙坦对2型糖尿病大鼠肾组织骨桥蛋白表达的影响

缬沙坦对2型糖尿病大鼠肾组织骨桥蛋白表达的影响

王菁孙健美

王菁孙健美（青岛大学医学院附属医院海阳分院肾内科山东海阳265100）

【中图分类号】R587.1【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2011）23-0056-02

【摘要】本文通过探讨缬沙坦对2型糖尿病大鼠肾脏骨桥蛋白（OPN）表达的影响，得出结论：缬沙坦可减少肾组织巨噬细胞浸润及减少细胞外基质，对糖尿病肾病有保护作用,其机制可能与下调TGF-β1、OPN的表达有关。

【关键词】缬沙坦糖尿病肾病转化生长因子-β1骨桥蛋白巨噬细胞

糖尿病肾病(DN)发病率高，治疗棘手、疗效差，危害极大。本研究旨在通过观察OPN在DN大鼠肾小球及肾间质的表达的变化，探讨ARB制剂缬沙坦对其影响，进一步阐述ARB制剂DN肾脏保护作用的机制。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物SPF级雄性Wistar大鼠50只，体重200±20g左右，青岛市药检所实验动物中心提供。大鼠自由饮水、进食,保持垫料干燥。在室温22±1℃、相对湿度55±5%、光照周期12h-12h环境中，大鼠适应性喂养1周后进入试验。

1.1.2受试药品缬沙坦（代文），北京诺华制药有限公司生产。

1.1.3主要试剂和仪器链脲佐菌素(STZ)；血清胰岛素、糖化血红蛋白（HbA1c）及尿白蛋白试剂盒；山羊抗人OPN、TGF-β1单克隆抗体；小鼠抗大鼠ED-1抗体及纤连蛋白（FN）抗体；生物素化山羊抗兔、抗鼠IgG或兔抗山羊IgG及链霉亲和素A-生物素A-辣根过氧化物酶复合物(SABC)工作液、DBA试剂；Trizol和PCR试剂盒；引物合成于上海生工生物工程技术服务有限公司。美国DSL公司鼠尾无创血压测量仪LE5002。

1.2方法

1.2.1动物模型的建立及分组将实验动物随机分为正常对照组(NC组)（n=10只）和模型组，即高糖高脂喂养组（n=40只），予以造模。将造模成功的DM大鼠随机分成2组:DM模型组和缬沙坦治疗组（DT组）。DT组给予缬沙坦25mg•kg-1.d-1灌服，NC组和DM组每日给予等量生理盐水，共治疗12周。DM大鼠在整个实验期间均不应用胰岛素及降糖药。

1.2.2标本收集实验结束前称大鼠BW，鼠尾血压仪测量大鼠平均动脉压（MAP）。处死前以代谢笼收集24h尿，测尿量，离心分装后保存于-70℃冰箱中待测尿（Ucr）、UAL含量。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉下，针刺心脏采血，4℃离心，取血清保存于-20℃冰箱中待测血肌酐(Scr)、BG、TG、CH水平。称肾重(KW)后，置于冰上，取8mm3大小肾组织置于4%的多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋，多聚赖氨酸处理切片，3μm厚，进行光镜检测及免疫组化研究。剩余肾组织切成小块置于液氮中，冻透后转入-70℃冰箱中待行实时定量PCR检测。

1.2.3血胰岛素、HbA1c及尿UAL测定按照试剂盒说明书，采用酶联免疫吸附法（ELISA法）检测。UAL的排泄量以UAL/Ucr比率表示。

1.2.4血、尿生化指标检测利用青岛大学医学院附属医院检验科的日立7020生化分析仪检测BG、血肌酐(Scr)、尿肌酐(Ucr)、TC、TG。

1.2.5肾脏病理检查HE、PAS、Masson三色染色观察肾组织病理变化。

1.2.6免疫组织化学染色采用SP法，操作步骤按试剂盒说明书进行。

1.2.7实时定量PCR检查应用ABI7500Real-TimePCRSystem两步法PCR扩增标准程序，严格按照说明书进行实时定量PCR的操作。

1.2.8统计学分析数据以均数±标准差(x-±s)表示，多组间比较若方差齐，采用One-WayANOVA检验，若方差不齐采用q检验。部分数据间做相关分析，计算相关系数r，P<0.05有统计学意义。所有数据应用SPSS16.0软件进行统计学分析。

2结果

2.1各组大鼠物理及生化指标的变化实验9周末，在40只造模大鼠中，28只大鼠成功造模，出现FBG、MAP、HbA1c、CH、TG明显升高及胰岛素抵抗，造模成功率为70%。

实验17周末，与对照组比较，DM组MAP、FBG、KW、KW/BW、UAL及Ccr显著升高；与DM组相比，缬沙坦治疗组大鼠MAP、KW/BW均明显下降，Ccr明显降低，UAL显著减少。BG、CH、TG虽有下降趋势，但无统计学差异。

2.2肾组织病理学改变光镜检查显示，NC大鼠肾组织结构正常；DM大鼠肾组织出现系膜区增宽、细胞外基质增多、肾小球硬化及肾间质纤维化,与NC组比较，DM大鼠的GSI、RIFI明显升高；DT大鼠肾脏病理不同程度得到改善，DT组大鼠的GSI、RIFI较DM大鼠降低。

2.3各组大鼠肾脏ED-1阳性细胞数变化与NC比较，DM大鼠肾小球及肾间质的ED-1阳性细胞数显著增多，与DM组比较，DT肾组织的ED-1阳性细胞数明显减少。肾小球ED-1阳性细胞与GSI明显相关；肾间质ED-1阳性细胞数与RIFI也相关。

2.4OPN、TGF-β1及FN肾组织蛋白表达免疫组化显示：DM组和DT组大鼠肾小球及肾间质OPN、TGF-β1及FN表达均上调，高于NC组；DT组OPN、TGF-β1表达上调的程度低于DM组。肾间质ED-1阳性细胞与OPN及TGF-β1的蛋白表达呈正相关。

2.5OPN及TGF-β1肾组织mRNA表达实时定量PCR结果显示：与NC组比较，DM组和DT大鼠肾组织OPN、TGF-β1mRNA表达升高；而DT大鼠肾组织OPN、TGF-β1表达均低于DM组，差异有统计学意义。

3讨论

DN发病机制除高糖、血液动力学异常与血脂代谢紊乱外,炎症可能参与DN发生、发展,有学者甚至认为炎症是DN发生、发展的中心环节，并与其预后相关。

TGF-β1为DN发病过程中肾小球与肾小管间质损害最为肯定的关键生长因子,它通过多途径、多机制调节发挥其致病作用。并往往作为评价指标。本研究发现：OPN表达上调及巨噬细胞浸润参与DN的病理过程。

本实验发现缬沙坦可通过抗炎、抑制巨噬细胞浸润及减少ECM发挥其肾脏保护作用，其抗炎、抑制巨噬细胞浸润及减少ECM等多方位机制可能与抑制肾组织OPN、TGF-β1的表达有关。

参考文献

[1]马瑞霞,刘丽秋,徐岩等.雷公藤甲素对2型糖尿病大鼠肾脏的保护作用.中华高血压杂志,2008,16(12):1120-1124.

[2]TuttleKR.Linkingmetabolismandimmunology:diabeticnephropathyisaninflammatorydisease[J].JAmSocNephrol,2005,16(6):1537-1538.