一株非典型解脲棒杆菌的临床分离与鉴定

一株非典型解脲棒杆菌的临床分离与鉴定

何永文1屈平华2张妮3杨雅超1袁慧3陈茶2

何永文1屈平华2张妮3杨雅超1袁慧3陈茶2

（1广东省广州市番禺区石楼人民医院广东广州511447）

（2广东省中医院检验医学部广东广州510006）

（3广东中医药大学第二临床医学院在读研究生广东广州510006）

【摘要】目的对一泌尿系统感染患者进行病原菌的分离及菌种鉴定。方法按《全国临床检验操作规程》第三版的方法进行中段尿的分离培养与菌落计数。以商品化Vitek2细菌鉴定系统、德灵Autoscan-4阳性菌PC20复合鉴定板、APIStaph、APICoryn鉴定试条、K-B法药敏实验、以及细菌的16S核糖体核糖核酸（rRNA）基因测序分析对分离的病原菌进行多相分类学鉴定。结果该泌尿系统感染患者中累计9次均分离到一种革兰阳性球菌，菌落计数均＞5万cfu/ml，其血平板不溶血，触酶、脲酶、碱性磷酸酶均阳性，硝酸盐还原、明胶液化、葡萄糖发酵、麦芽糖发酵、蔗糖发酵等阴性，药敏分析显示对青霉素、苯唑青霉素、复方新诺明、利福平、环丙沙星、氧氟沙星、庆大霉素等耐药，但采用APIStaph、Autoscan-4PC20、Vitek2GP67鉴定卡均无法鉴定。16SrRNA基因序列分析显示与解脲棒杆菌模式菌种的相似度为100%，可鉴定为解脲棒杆菌，其脂质需求实验阳性，生化特征及耐药性亦符合解脲棒杆菌的特征，但其球状的菌体形态与典型解脲棒杆菌的“栅栏状排列”小杆菌存在明显的差异。结论该泌尿系统感染的病原菌可能为解脲棒杆菌的一个新的变种。

【关键词】棒杆菌尿路感染序列分析

【中图分类号】R379.1【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）08-0035-03

棒杆菌（Corynebacterium）是—种需氧生长、不产生芽孢、抗酸染色阴性、革兰阳性杆菌，隶属于放线菌属目的棒状菌科，目前已发现有100余个种和亚种，其中与临床相关的菌种多达40多个[1]。近年来，由棒杆菌引起内源性感染的临床报道呈上升趋势，然而，由于棒杆菌种类繁多，确切的分类与鉴定较为困难。通常，根据棒杆菌对脂质的需求，可将其分为脂质需求性和非脂质需求性棒杆菌两大类。就现有的研究资料来看，大多数棒杆菌为非脂质需求性，其能在普通的血平板生长良好，菌落直径通常大于2mm；少数为脂质需求性棒杆菌，如杰氏棒杆菌（C.jeikeium）、拥挤棒杆菌（C.accolens）、麦氏棒杆菌（Corynebacteriummacginleyi）等，其对于脂质具有特定的需求，在不含脂质的普通血平板上的菌落直径通常小于0.5mm，但在添加0.1～1%（V/V）吐温80的血平板上的菌落直径则可以达2mm以上[2]。

解脲棒杆菌（C.urealyticum）为脂质需求性棒杆菌中的一种，正常存在于人类皮肤和黏膜，主要在免疫力低下人群、或长期使用抗生素治疗的老年住院患者中引起感染，可引起泌尿系统疾病如急性膀胱炎、肾盂肾炎、结痂性膀胱炎、溃疡结痂性肾盂炎、结石等泌尿系统疾病，此外，还可引起软组织感染、伤口感染、败血症、骨髓炎、心内膜炎、肺炎等多种疾病[3]。2012年2月，在我医院一病人尿液中多次分离的一株革兰阳性杆菌进行鉴定，最终确定了一例非典型解脲棒杆菌引起泌尿系统感染，现报道如下。

1.对象与方法

1.1对象/病例摘要：某高龄女，89岁，长期卧床，因反复咳痰、气喘加重入院，有肺部感染、慢性阻塞性肺病、急性左心衰、高血压病、食道裂孔疝等基础病史，及股骨颈骨折、结肠癌根治等手术史。入院体检：体温36.5℃，脉博81次/分，血压178/118mmHg。血常规：WBC11.7×109/L，N79.6%，Hb107g/L。留置导管导尿2周，有尿路感染指征，尿常规：白细胞阳性（++）、红细胞阳性（+++）。尿培养分离到解脲棒杆菌，采用氧氟沙星、头孢呋辛均未见效果，更换留置导管，换用利奈唑胺治疗后白细胞消失，复检尿培养无菌生长，出院后愈后良好。

1.2仪器与试剂：TE9600基因扩增仪（珠海黑马公司）；恒温金属浴器（杭州博日公司）；Baso快速革兰染色液；Autoscan-4半自动细菌鉴定系统与配套的PC20鉴定卡（美国德灵）；Vitek2细菌鉴定系统与配套的GP67鉴定卡（法国梅里埃）；APIStaph与APICoryn鉴定试条（法国梅里埃）；PremixExTaq酶体系（大连Takara）,抗生素药敏纸片（Oxoid）。细菌分离培养基:血平板、巧克力、麦康凯平板、脑心浸液肉汤与含1%吐温80的脑心浸液肉汤等，购自江门凯林。

1.3标本的采集及处理：《全国临床检验操作规程》第三版的留置导管集尿的尿培养方法：用70%酒精消毒导管口，用针筒抽取5-10mL尿，置于无菌容器中送实验室。

1.416SrRNA基因测序及序列分析：16SrRNA基因扩增采用通用引物27f（5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’）与1492r（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）,该步骤由广东省中医院检验医学部完成。扩增条件参考文献[4]。扩增产物经电泳检测后，PCR产物按东盛PCR回收纯化试剂盒说明书进行产物的回收纯化，并送与上海英韦创津广州公司进行基因测序。获得的16SrRNA基因序列在NCBI库中进行Blast同源性比对，初步确定其分类位置。

1.5系统生化鉴定与药物分析：脂质需求实验参考Riegel等[5]介绍的方法，比较在不含吐温80的脑心浸液肉汤、以及含1%吐温80的脑心浸液肉汤中的生长状况。仪器鉴定采用.Vitek2全自动细菌鉴定系统GP67鉴定卡片，以及Autoscan4操作步骤参考仪器说明书。生化鉴定采用APIStaph与APICoryn鉴定试条，其操作步骤按说明书进行。药敏试验采用K-B法，参考CLSIS-100葡萄球菌的药敏标准进行结果解释。

2.结果

2.1尿涂片与细菌培养结果：连续9次均分离到一种革兰阳性球菌，其在血平板上培养48h生长良好，形成针尖样大小、灰白色、平滑、圆形、凸起、不透明、不溶血菌落，转种麦康凯平板无生长。对尿培养标本进行菌落计数，其中3次计数＞10万cfu/ml，6次计数＞5万cfu/ml。取尿标本离心镜检，亦革兰阳性球菌及发现大量脓细胞，按《全国临床检验操作规程》第三版，其具有显著的临床意义，应进行菌种鉴定及药敏分析。

2.2表型鉴定与药敏分析：根据革兰染色特征，采用Vitek2细菌鉴定系统配套的GP67鉴定卡以及Autoscan-4PC20进行鉴定，均无鉴定结果。按革兰阳性球菌鉴定法则，选用葡萄球菌的APIStaph试条亦无鉴定结果，且除触酶、脲酶实验阳性外，其他的所有糖发酵实验、酶类实验等均无反应，因此，从糖发酵实验的结果来看，尽管该菌的菌体形态为革兰阳性球状，但生化特征与葡萄球菌、微球菌的特征并不相符。参考CLSIS-100葡萄球菌的药敏解释标准，结果显示该分离菌对青霉素、红霉素、克林霉素、头孢唑啉、庆大霉素、环丙沙星、头孢唑啉、复方新诺明、呋喃妥因、利福平等多种抗生素呈现耐药性（见表1）。

表1.分离株与脂质需求性棒杆菌生化实验的比较

2.3基因测序鉴定及结果分析：扩增得到16SrRNA基因的全序列，大小约1500bp。PCR产物送与上海英骏广州公司进行测序。由毛细管电泳峰形来看，其前后峰形大小一致，无杂带、无背景信号干扰，可认为其测序结果有效。以DNAMAN软件对基因序列的拼接，得到1355bp有效序列，以Blast(www.ncbi.him.nih.gov/blast)的ref_rRNA库进行分析，显示与解脲棒杆菌（Corynebacteriumurealyticum）仅存在2个碱基的差异，相似率为99.8%；与Corynebacteriumfalsenii存在15个碱基的差异，相似率为98.9%；与杰氏棒杆菌（C.jeikeium）存在18个碱基的差异，相似率为98.7%；此外，再无相似率大于98.0%的模式菌株。参考CLSIMM18-A的基因测序鉴定解释标准，该菌可直接鉴定为解脲棒杆菌[6]。

2.4基于16SrRNA基因序列分析的生化表型鉴定：根据基因16SrRNA基因序列分析提示的“解脲棒杆菌”鉴定结果，采用APICoryn鉴定试条，鉴定的生物编码为2101004，亦鉴定为解脲棒杆菌，可信度为96.2%，即其表型特征与基因鉴定的结果相符。将该菌接种于不含吐温80的脑心浸液肉汤及含1%吐温80的脑心浸液肉汤中，结果显示该菌在含1%吐温80的脑心浸液肉汤中37℃孵育72h呈明显的浑浊生长，但在不含吐温80的脑心浸液肉汤则无明显生长的迹象，即该菌的脂质需求实验阳性，其与脂质需求性棒杆菌的生化特征比较见表2。

表2.分离株与脂质需求性棒杆菌生化实验的比较

注：符号缩写：V，可变；F，发酵；O，氧化；+，阳性反应；++，强阳性反应；－，阴性反应

3.讨论

近年来，由棒杆菌引起内源性感染的临床报道呈上升趋势，人们对棒状杆菌的临床认识亦逐步提高。目前，国内已有多种棒杆菌的临床报道[7-9]，此外，还有对碱性尿路感染中解脲棒杆菌培养的分析[10]。然而，棒状菌广泛存在于人体体表的各个部位及外环境中，不正确的采样即可能分离到棒状杆菌，因此，评价棒状菌临床分离株的价值和意义通常十分重要。一方面，要求一线的医护人员规范留取标本，以防范不规范采样而导致的体表正常菌群污染。另一方面，对于从临床分离得到可疑阳性菌，微生物检验人员也应该加强与临床医生的交流沟通，若患者有相应的临床症状，则应该充分重视。通常，从多份标本中同时分离，或直接涂片染色发现与培养结果相一致的病原菌、且观察到强烈的白细胞反应时，则更具有临床意义。本例研究报告中，连续9次从留置尿标本中分离到同一种细菌，且尿涂片镜检发现了革兰阳性菌，其临床意义非常明确。分离得到的病原菌在经过16SrRNA基因序列分析并对比确定后，又运用APICoryn鉴定试条进行了复核，并且，从临床反馈的信息来看，其治疗效果与细菌学检验的结果相吻合，故可以确定该泌尿系统感染的病原菌为解脲棒杆菌。但值得注意的是，该病原菌与解脲棒杆菌模式菌株在存在一定程度的差异，其菌体形态为球状，与典型的解脲棒杆菌的“栅栏状排列”小杆菌存在明显的差异，初步分析其可能是解脲棒杆菌的一个变种，具体还有待于进一步的研究。

该病原菌的鉴定，同时从某种程度上也反应出了当前大多数医院、特别是我们基层医院微生物实验室所存在的缺陷和不足。总体而言，当前微生物检验所存在的缺陷和不足，主要体为：对于自动化仪器的过份依赖，对传统手工试验方法的丢失，以及分子生物学手段的缺失。此株解脲棒杆菌先后9次从留置尿标本中分离，然而由于该细菌不在Autoscan-4PC20及Vitek2GP67的数据库，一时之间找不到确切的鉴定方法，最终在广东省中医院的帮忙下，我们运用了16SrRNA基因序列鉴定的手段，快速准确地该病原菌进行了分类。因此，从微生物鉴定

发现的趋势来看，16SrRNA基因序列分析是能够将疑难菌株进行准鉴定的好方法。但需注意的是，由于广泛PCR扩增的高度灵敏性，可能会出现非目的菌株的核酸污染而出现假阳性扩增，因此，对于基因测序的结果，最好能再结合生化、药敏等反应对其进行多相分类学分析，以达到更精准的鉴定效果。

参考文献

[1]陈东科,孙长贵.实用临床微生物学检验与图谱.北京,人民卫生出版社,2011,p242.

[2]FunkeG,vonGraevenitzA,ClarridgeJE3rd,etal.Clinicalmicrobiologyofcoryneformbacteria.ClinicalMicrobiologyReviews.1997,10:125–159.

[3]SorianoF,TauchA.MicrobiologicalandclinicalfeaturesofCorynebacteriumurealyticum:urinarytractstonesandgenomicsastheRosettaStone.ClinMicrobiolInfect,2008,14:632–643.

[4]屈平华,赵红波,黄彬,等.卫生部微生物室间质评1012菌的鉴定与放线菌属的系统发生分析.中华检验医学杂志,2011,9:814-819.

[5]RiegelP,RuimyR,deBrielD,etal.Genomicpersityandphylogeneticrelationshipsamonglipid-requiringdiphtheroidsfromhumansandcharacterizationofCorynebacteriummacginleyisp.nov.IntJSystBacteriol.1995,45:128-133.

[6]CLSIMM18-A.InterpretiveCriteriaforIdentificationofBacteriaandFungibyDNATargetSequencing;ApprovedGuideline.

[7]李百利,刘志军.解脲棒杆菌致医源性尿路感染1例.中华医院感染学杂志.2002.12:493-493

[8]范广忠,高文杰,郑雪峰,等.干燥棒杆菌致经产妇败血症1例.中华医院感染学杂.2004,14:1107-1107

[9]吴立奇.失代偿性肝硬化合并假白喉棒杆菌原菌及L型败血症1例.中国微生态学杂志,2004,16:F003-F003

[10]杨玮,詹碧翠.碱性尿路感染中解脲棒杆菌培养的分析.实用医技杂志,2007,14:1813-1815.