多重PCR法检测金黄色葡萄球菌spa、mecA和pvl基因

多重PCR法检测金黄色葡萄球菌spa、mecA和pvl基因

陈述1张海1吴亮2

（1江苏大学附属医院普外科江苏镇江212001）

（2江苏大学医学院江苏镇江212013）

【摘要】目的：建立一种快速诊断MRSA菌及细菌毒力评估的新方法。方法：根据金黄色葡萄球菌上述基因序列设计引物，采用多重PCR法扩增20株金黄色葡萄球菌，2%琼脂糖凝胶电泳分析产物，确认细菌携带基因。结果：多重PCR法结果中，spa基因扩增产物大小为170bp×n，mecA基因扩增产物大小为162bp，pvl基因扩增产物大小为80bp。结论：多重PCR法可以快速检测金黄金葡萄球菌spa基因、mecA基因和pvl基因，可以用快速诊断MRSA菌和评估细菌毒力。

【关键词】金黄色葡萄球菌；多重PCR；spa；mecA；pvl

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2016）35-0391-02

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus,Sau）是引起医院内感染常见菌，可造成各种化脓性感染，及骨髓炎、心内膜炎等严重致命性感染[1]。病灶内Sau毒素释放入血还可引起患者多器官功能障碍甚至死亡[2]。近年来抗生素的大量使用造成耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（methicillin-resistantstaphylococcusaureus,MRSA）分离率逐年增高，已成为临床医生必须面对的一个巨大挑战。

spa基因是Sau特有基因，可以根据该基因对Sau菌开展鉴定分型。mecA基因是MRSA菌标志基因，是诊断MRSA菌的金标准。pvl基因近年来发现的Sau菌主要毒力因子，带有pvl基因的Sau菌致死率显著高于不携带菌株[3]。本研究设计出一种多重PCR方法可以同时检测受测Sau菌株spa基因、mecA基因和pvl基因。

1.材料和方法

1.1菌种

本研究所用Sau菌株均来自于江苏大学附属医院，经法国生物梅里埃公司全自动微生物分析仪鉴定为金黄色葡萄球菌。MRSA菌检测采用头孢西丁纸片法，以抑菌圈直径≤21mm判断为MRSA菌株。

1.2引物

根据金黄色葡萄球菌spa基因、mecA基因和pvl基因设计多重PCR引物，引物序列如下（见表1）：

1.3多重PCR扩增

用接种环刮取过夜培养于血琼脂平板上单个菌落，直接煮沸后取上清即为DNA模板。在PCR管中依次加入PCR预混液12.5μl，spa基因引物各0.25μl，mecA基因引物各0.5μl，pvl基因引物各2μl，加入DNA模板2μl，最终以灭菌双蒸水补足总体系至50μl。扩增条件为94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸1min，共进行30个循环。PCR扩增产物电泳后经EB染色于紫外灯下结果，照相记录。

2.结果

2.1多重PCR检测结果

20株Sau菌均扩增出spa基因条带，但分子量并不完全相同；9株MRSA菌扩增出mecA基因条带，大小约为160bp；仅1株Sau菌扩增出pvl基因，条带大小为80bp（见图1）。

图1Sau菌株多重PCR检测结果。1-10号样本为MRSA菌，

11-20号样本为非MRSA菌。

3.讨论

研究结果表明，我们设计的多重PCR方法可以用于同时检测Sau菌spa基因、mecA基因和pvl基因。该方法快速简便，可用于临床快速检测Sau菌感染，并评估其毒力。

spa基因序列常用于Sau菌分型，可以用于临床简单分析菌株同源性，为院内感染的防控提供理论支持[4]。MRSA菌是目前临床耐药性较为严重的一类Sau菌，mecA基因是判断MRSA菌的“金标准”[5]。传统MRSA检测方法至少需要24h以上，普及MRSA菌的分子生物学检测方法势在必行。

pvl是近年来新发现的Sau菌毒力因子，该毒素素能够特异性作用于人体白细胞，并造成大量白细胞死亡，导致机体防御屏障和免疫应答能力的丧失。近年来的临床研究发现，携带pvl基因的Sau菌诱发的肺炎死亡率高达70%，其中以携带pvl基因的MRSA菌最为凶险[6]。本研究建立的多重PCR法具备同时检测Sau菌pvl基因和mecA基因能力，对感染者诊断和治疗尤为有利。今后有必要进一步加强肺炎病人筛查，提高Sau肺炎治愈率。

【参考文献】

[1]McDanel,JS,PerencevichEN,StormJ,etal.IncreasedMortalityRatesAssociatedwithStaphylococcusaureusandInfluenzaCo-infection,MarylandandIowa,USA[J].EmergInfectDis.2016,22(7):1253-1256.

[2]Chambers,HF.ThechangingepidemiologyofStaphylococcusaureus[J].EmergInfectDis.2001,7(2):178-182.