复方丹参注射液对人脐静脉血管内皮细胞株HUVEC生长的影响

复方丹参注射液对人脐静脉血管内皮细胞株HUVEC生长的影响

蒋红1,2何城3贾艾敏2王丽恒2雷佳红1,2

(川北医学院附属医院风湿免疫研究所四川南充637000）

（2川北医学院附属医院医学研究中心四川南充637000）

（3川北医学院附属医院检验科四川南充637000)

【摘要】目的：观察复方丹参注射液对人脐静脉血管内皮细胞株（HUVEC）生长的影响。方法：取HUVEC进行传代培养，将其置于96孔培养板中，设置正常组、丹参组、空白组，每组分别设置8个复孔。向正常组和丹参组中分别加入无菌生理盐水、复方丹参注射液（1.25mg/ml），空白组不加任何药液，造模成功后进行培养。采用四唑盐比色（MTT）法分别检测各组的OD值，并对比三组之间的丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）含量。结果：丹参组OD值显著低于正常组和空白组，组间差异均有显著性（P＜0.05），而正常组与空白组OD值比较差异均无显著性（P＞0.05）；丹参组MDA、NO的含量也均显著低于正常组和空白组（P＜0.05），而正常组与空白组MDA、NO的含量比较差异均无显著性（P＞0.05）。结论：复方丹参注射液有助于改善HUVEC的生长和增殖状态，还可下调HUVEC中MDA和NO分泌与合成水平，有助于减轻氧化应激损伤。

【关键词】复方丹参注射液；人脐静脉血管内皮细胞株；丙二醛；一氧化氮；氧化应激

【中图分类号】R285.1【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2017）29-0045-03

EffectsofCompoundSalviaInjectionontheGrowthofHumanUmbilicalVeinEndothelialCellLineHUVEC

JiangHong1,2,HeCheng3,JiaAimin2,WangLiheng2,LeiJiahong1,2,3,YangMinghui1,2,3.

TheAffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege:1.InstituteofRheumatismImmunity,2.MedicalResearchCenter,3.DepartmentofClinicalLaboratory,NanchongSichuan,637000,China

【Abstract】ObjectiveToobservetheeffectofCompoundSalviaInjectiononthegrowthofhumanumbilicalveinendothelialcellline(HUVEC).MethodsHUVECwasculturedinthe96holecultureplate,thenormalgroup,Salviagroupandblankgroupwereset,andeachgroupwassetwith8holes.Aftersuccessfulmodeling,thenormalgroupandSalviagroupwereculturedwithsterilephysiologicalsaline,compoundSalviainjection(1.25mg/ml)respectively,theblankgroupdidnotaddanyliquid.Usingfourtetrazolium(MTT)colorimetricmethodrespectivelytodetecttheODvalue,andcomparedbetweenthethreegroupsofmalondialdehyde(MDA),nitricoxide(NO)content.ResultTheODvaluesofSalviagroupwassignificantlylowerthanthatofnormalgroupandblankgroup,thereweresignificantdifferencesbetweenthegroups(P<0.05),butthedifferencebetweennormalgroupandtheblankgroupwasnotsignificant(P>0.05);thecontentofMDAandNOinSalviagroupweresignificantlylowerthanthatofnormalgroupandblankgroup(P<0.05),andtherewerenosignificantdifferencebetweennormalgroupandblankcontrolgroupMDA(P>0.05).ConclusionCompoundSalviainjectioncanhelptoimprovethegrowthandproliferationofHUVEC,andalsocandownregulatethesecretionandsynthesisofMDAandNOinHUVEC,whichishelpfultoreduceoxidativestressdamage.

【Keywords】CompoundSalviainjection;Humanumbilicalveinendothelialcellline;Malondialdehyde;Nitricoxide;Oxidativestress

复方丹参注射液具有活血化瘀的功效，常用于各种心血管疾病治疗中，并且对内皮细胞功能损伤有一定的控制作用，但是复方丹参注射液对心血管疾病患者内皮细胞的保护作用机制尚未阐述清楚，仍需要给予进一步的探讨观察[1-2]。为此，本研究特选取人脐静脉血管内皮细胞株（HUVEC）开展实验观察，并探讨复方丹参注射液对于氧化应激损伤的控制作用，详情如下。

1.材料与方法

1.1研究材料

细胞：人脐静脉血管内皮细胞株HUVEC由本院风湿免疫研究所保存。

1.2主要试剂和仪器

注射用丹参（冻干）（哈药集团中药二厂）；无菌生理盐水（四川科伦药业股份有限公司）；胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）（均购自美国Gibco公司）；胎牛血清、1640培养液（均购自HyClone公司）；PBS缓冲液（北京中杉金桥生物技术有限公司）；青霉素和链霉素（均购自石家庄华北制药股份有限公司）；甲基偶氮唑蓝（MTT，美国sigma公司），用磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.2）配制成5mg/ml的溶液，-20℃避光保存。一氧化氮（NO）和丙二醛（MDA）检测试剂盒（购自深圳晶美生物科技有限公司）；生物安全柜（HR60-IIA2）、CO2培养箱（HealForceHF90）、低温台式离心机（UNIVERSAC16R，USA）、倒置显微镜及成像系统（OLYMPUS的IX71及CoolSNAP，JAPAN）、酶标仪（美国Bio-RAD）、紫外线分光光度计（美国PuIt，P200+）、全自动生化分析仪（OLYMPUS）等。

1.3方法

1.3.1细胞培养人脐静脉血管内皮细胞株HUVEC细胞用含双抗（100U/ml青霉素、100mg/L链霉素）、含10％胎牛血清的1640培养液，在37℃、5%CO2培养箱中进行培养，倒置显微镜下观察细胞生长情况。待细胞密度为90%左右时，去掉培养液，用PBS洗涤细胞三次，吸干瓶内液体，即加0.25％的胰酶溶液（以覆满瓶底为限）将贴壁细胞消化分离，后加入完全培养液，轻轻吹打均匀，使细胞彻底从培养瓶底壁脱落，按1：3比例进行传代培养。取处于对数期的、生长状态良好的细胞进行实验。

1.3.2分组及内皮细胞损伤造模方法取上述细胞进行实验，设置三组，分别为正常组、丹参组和空白组，每组设置8个复孔。其中丹参组中加入复方丹参注射液使其终浓度为1.25mg/ml，正常组中加入同等体积的无菌生理盐水，而空白组不给予任何药物干预。

参照刘莉萍[3]的方法进行细胞缺氧/复氧损伤模型建立。造模成功后，更换为无血清的1640培养液，并分别向各组加入对应的药液，在37℃、5%CO2的培养箱常规培养12h。

1.3.3采用MTT法检测各组OD值[4]取处于对数生长期的HUVEC细胞，用含10%胎牛血清的1640培养液配制成5×103个/ml的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔200μl，共三组，每组8个复孔。24h后细胞基本贴壁，按以上分组情况加药，加药后继续培养12h吸去原培养液，每孔加200μl无血清1640培养液及20ulMTT，继续培养4h。2000r/m离心10分钟后小心吸取上清弃之，每孔加入150μlDMSO，振荡10min后，在酶标仪上于波长490nm处检测各组吸光度值（OD值）。

1.3.4MDA、NO测定方法按1.3.3的方法进行铺板，铺板24h后进行细胞缺氧/复氧损伤模型建立。造模成功后，全部更换为无血清的1640培养液，并分别向各组加入对应的药液，在37℃、5%CO2的培养箱常规培养12h。收集各孔的上清液采用全自动生化分析仪、紫外线分光光度仪以及对应试剂盒完成检测，检测方法分别为紫外线分光光度法和硝酸还原酶法。

1.4观察指标

对比三组OD值；对比三组MDA、NO测定结果。

1.5统计学分析

采用SPSS19.0版本软件开展统计学分析，多样本计量资料（x-±s）和两样本计量资料比较分别采用方差分析和t检验，P＜0.05均为差异有统计学意义的前提。

2.结果

2.1三组OD值比较

正常组、丹参组与空白组OD值比较差异有统计学意义（P＜0.05），且丹参组OD值明显低于正常组和空白组（P＜0.05），详见表1。

3.讨论

血管内皮细胞损伤是各种心血管疾病发生的共同基础，同时也是导致动脉粥样硬化病变的重要原因[5]。对于心肌梗死患者来说，溶栓治疗可以促进局部血供的快速恢复，但是缺血再灌注损伤也是严重影响患者生存质量和预后的重要因素，因此改善血管内皮细胞功能、预防血管内皮细胞损伤是各种心血管疾病治疗中的关键措施[6]。内皮细胞损伤的诱发因素有很多，如脂肪酶、细胞因子和活性氧等，而内皮细胞功能损伤的重要原因是氧化损伤。研究指出，动脉粥样硬化发生的基础便是血管内皮细胞损伤，因此在对各种心血管疾病治疗时均应当考虑采取有效的手段保护血管内皮细胞，避免损伤加重。

MDA和NO均是氧化应激损伤评估中的重要指标，在各种心血管病患者中，两种因子的产生主要是由于缺血再灌注损伤导致的。随着病情加重，大量氧自由基产生，介导内皮细胞与白细胞产生相互损伤作用，同时还可以促使白细胞在滚动、减速、紧密黏附、游出和变性等方面的活动能力显著增强，浸润组织进而发生急性炎症反应。另外，MDA和NO在缺血性心血管疾病患者中水平的异常升高还可改变毛细血管通透性，从而导致局部组织出现缺血、出血、水肿和坏死等病理改变，加重机体的损伤程度。由此可知，在对心血管疾病治疗中为了改善内皮细胞功能，需要抑制MDA和NO的分泌，借此达到理想的控制氧化应激损伤的目的。

复方丹参注射液是从中药丹参中精制而成的，具有活血化瘀、培本固元的功效[7]。近年来随着人们对于中医药作用认识的不断加深，复方丹参注射液逐渐在各种心血管疾病患者中得到广泛的应用。研究显示[8]，复方丹参液辅助治疗急性心肌梗死和冠心病患者时能够改善心功能相关指标，同时还可减轻炎症反应，降低血清MDA和NO的表达水平，由此可知该药物能够通过减轻心血管疾病患者的氧化应激损伤，从而对血管内皮细胞起到一定的保护作用。相关实验研究显示[9]，对实验大鼠急性心肌梗死损伤模型实施复方丹参注射液灌胃配合其他常规治疗后，可以发现接受复方丹参注射液灌胃处理的大鼠预后效果明显好于未接受复方丹参注射液灌胃处理的大鼠，且前者血清MDA、NO水平显著低于后者，前者心肌细胞在光学显微镜下观察发现变性坏死的情况明显少于后者，证实复方丹参注射液能够减轻氧化应激损伤。本研究中丹参组OD值、MDA、NO表达水平均明显优于正常组和空白组，说明复方丹参注射液有助于控制机体氧化应激损伤。

综上，复方丹参注射液有助于改善HUVEC的生长和增殖状态，还可下调HUVEC中MDA和NO分泌与合成水平，有助于减轻氧化应激损伤。

【参考文献】

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[2]邬浩杰.丹参的药理作用研究.浙江中医药大学学报，2008，32（5）：694-695.

[3]刘莉萍，杨耀防，何明，等.二苯乙烯苷对人脐静脉血管内皮细胞缺氧复氧损伤的影响[J].中国组织工程研究，2009，13（7）：1320-1323.

[4]彭乙华，曾恒礼，蒋红，等.苦碟子对人脐静脉血管内皮细胞株HUVEC生长的影响[J].川北医学院学报，2011，26（6）：480-482.

[5]杜利君，蒋兴亮.人脐静脉内皮细胞的分离及原代培养体会[J].川北医学院学报，2013，28（1）：48-51.

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[7]蒋红，刘青松，凡瞿明，等.丹参体外抑制类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖的研究[J].中华临床医师杂志：电子版，2010，4（4）：48-51.

[8]刘洪亮，吕靖，赵志敏，等.丹参水溶性成分抑制肝窦内皮细胞功能及血管新生的活性评价[J].中草药，2016，47（6）：938-943.

[9]陈瑶，王胜娟，李朝玲，等.丹参对于急性微循环障碍大鼠血管内皮细胞的保护作用[J].陕西中医，2016，37（4）：506-508.