川芎嗪对酒精性股骨头缺血性坏死骨细胞凋亡的影响

川芎嗪对酒精性股骨头缺血性坏死骨细胞凋亡的影响

蔡敏李宏宇来文兵杨勇

蔡敏李宏宇（通讯作者）来文兵杨勇（广西壮族自治区人民医院骨科广西南宁530021）

【摘要】目的探讨兔酒精性股骨头缺血性坏死骨细胞凋亡模型的建立。观察不同剂量川芎嗪对骨细胞凋亡率的影响和其对骨组织的保护作用。方法将实验组48只雄性家兔采用灌胃法，给予烈性普通白酒(含体积分数50%乙醇)8mL/(kg?d)，将实验组随机分成生理盐水对照组和3种不同剂量的盐酸川芎嗪干预组。另12只雄性家兔设为正常组不做任何处理。以上五组均用药观察至处死为止。于1、2、3、6个月分批处死。用TUNEL法检测各组间骨细胞凋亡情况。结果第三、六个月时大、中剂量川芎嗪组与生理盐水对照组相比较骨细胞凋亡数量逐渐减少，差异有统计学意义(P<0.05)；第六个月时大、中剂量川芎嗪组与正常组相比较骨细胞凋亡数量已较为接近(P＞0.05)。结论一定剂量范围、一定疗程的川芎嗪具有抑制骨细胞凋亡的作用。

【关键词】股骨头缺血性坏死凋亡川芎嗪酒精性

骨细胞凋亡，在正常的骨组织代谢和骨修复重建中发挥重要的作用[1]。骨细胞凋亡是除骨细胞坏死外股骨头缺血性坏死的另一种形式。国内外已经展开骨细胞凋亡在股骨头坏死中的研究[2]。本文通过建立兔酒精性股骨头缺血坏死模型，用不同剂量的盐酸川芎嗪进行干预，检测其细胞凋亡情况。观察不同剂量川芎嗪对骨细胞凋亡率的影响和其对骨组织的保护作用。

1、材料和方法

1.1实验动物和分组

成年雄性新西兰兔(广西医科大学动物实验中心提供)，体重(2.74±0.32)kg，共60只。随机选取12只，作为正常组（A组），不做任何处理。其余48只为实验组，参照已有文献[3]采用灌胃法，给予普通烈性白酒(含体积分数50%乙醇)8mL/(kg?d)，隔日一次。同时将实验动物随机分成4组给予不同干预，每组12只。B组为对照组，静脉注射生理盐水2ml，其余三组（C、D、E组）参照等效剂量系数折算法静脉注射大、中、小3种不同剂量（8mg/kg?d，4mg/kg?d，2mg/kg?d）的盐酸川芎嗪注射液。于1、2、3、6个月每组处死一批，每批3只，作骨细胞凋亡检测及电镜，观察两侧股骨头骨细胞凋亡情况。

1.2主要试剂

50％酒精含量的食用白酒(湖北神农酒业有限公司)，细胞凋亡检测试剂盒(武汉博士德生物工程公司)，川芎嗪注射液(广东南国药业有限公司规格2ml:40mg/支批号：H44023345)。

1.3骨细胞凋亡检测

采用原位末端标记法(TdT-mediateddUTPNickEndLabelingTUNEL)，参照说明书。在光镜下观察并摄片，实验设阳性对照与阴性对照染色，当胞核出现黄色颗粒，分布弥漫为阳性细胞（即凋亡细胞），少数细胞胞浆可同时阳性染色。每样本计数500个骨细胞，计算各组不同时期每1000个骨细胞中的阳性细胞数为凋亡细胞数。

1.4电镜观察

各组动物各取2只股骨头软骨及软骨下区2mm×2mm×1mm组织，用2.5%戊二醛前固定，10%EDTATris-HCl缓冲液（pH=7.4）脱钙，1%锇酸后固定，环氧树脂包埋，制作超薄切片，醋酸铀和枸椽酸铅染色，电镜观察细胞凋亡表现并摄片。

1.5数据处理：

应用SPSS16.0对各组数据进行统计分析。计量资料以-x±s表示，多样本均数的比较采用单因素方差分析，各川芎嗪组分别与生理盐水对照组均数间的两两比较采用LSD-t检验。按α=0.05水准，p＜0.05为差别有统计学意义。

2、结果

2.1骨细胞凋亡检测结果

正常组骨细胞凋亡不明显（见图1）。生理盐水对照组骨细胞凋亡第3个月时出现部分骨细胞凋亡（见图2），6个月时出现大量骨细胞凋亡（见图3）。第2、3、6个月时生理盐水对照组骨细胞凋亡数明显高于正常组（P<0.05），提示普通白酒灌胃法模拟人饮酒导致兔股骨头骨细胞凋亡（见表1-b）。第三、六个月时大、中剂量川芎嗪组与生理盐水对照组相比较骨细胞凋亡数量逐渐减少，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），提示大、中剂量川芎嗪对骨细胞凋亡具有显著性抑制作用；第六个月时大、中剂量川芎嗪组与正常组相比较骨细胞凋亡数量已较为接近，比较差异无统计学意义（P＞0.05），提示用药时间越延长，效果越明显。

表1各川芎嗪组与对照组不同时间骨细胞凋亡计数单位：10-3

注：a：同期正常组（A组）与各实验组（B、C、D、E组）相比较：P<0.05；

b：同期生理盐水对照组与正常组相比较：P<0.05；

c：第三个月时大、中剂量川芎嗪组与生理盐水对照组及正常组相比较：P<0.05；

d：第六个月时大、中剂量川芎嗪组与生理盐水对照组相比较：P<0.05，与正常组相比较：P＞0.05。

图1图2图3

图1正常组第6个月，骨细胞凋亡不明显（TUNEL×200）

图2对照组第3个月，部分骨细胞凋亡（TUNEL×200）

图3对照组第6个月，骨细胞凋亡明显增多(TUNEL×200)

2.2电镜观察结果

正常组第6个月骨细胞透射电镜下核完整，染色质均匀，核体积约占细胞的1/3（见图4）。对照组第6个月染色质浓密，电子密度增加，结构不清，但核膜仍完整等中、晚期细胞凋亡特征（见图5）。

图4TEM×6000图5TEM×6000

3、讨论

近年来，对酒精性股骨头坏死（AOFH)的发病机理研究已取得了很大的进展，但目前为止还没有一种学说可以完全阐述具体的发病机制。目前有关凋亡的研究已经渗透到骨骼系统基础和临床研究的各个方面，骨细胞、成骨细胞、软骨细胞存在凋亡。国内外众多学者认为，细胞凋亡在早期创伤性[4]、激素性[5]、酒精性[3]股骨头缺血坏死中起着重要作用。本课题第一步的研究中透射电镜观察到了实验组骨细胞有不同程度的核体积缩小、染色体固缩、边聚、电子密度增加和核膜完整等凋亡特征，提示在酒精性ANFH的骨细胞死亡过程中存在细胞凋亡现象。原位末端标记法凋亡计数中2、3、6个月时对照组凋亡细胞数明显高于正常组，并且随着时间推移，凋亡细胞逐渐增多，提示细胞凋亡参与酒精性ANFH的发生发展。

川芎嗪是川芎中提取的主要活性生物碱，化学名为四甲基吡嗪。临床应用广泛，目前主要用于缺血性心脑血管疾病的治疗。近年来也有不少川芎嗪治疗股骨头缺血性坏死的临床报道[6]。但川芎嗪对于酒精性ANFH的作用机理尚不清楚，本研究从抗细胞凋亡的角度做了探索研究。本文第三、六个月时大、中剂量川芎嗪组与生理盐水对照组相比较骨细胞凋亡数量逐渐减少，第六个月时大、中剂量川芎嗪组与正常组相比较骨细胞凋亡数量已较为接近，提示川芎嗪抑制骨细胞凋亡。

本研究证实川芎嗪具有明确的抗骨细胞凋亡效应，在一定剂量范围、一定疗程的川芎嗪具有抑制骨细胞凋亡的作用。其在治疗酒精性股骨头坏死方面的作用，将大大拓展其应用范围，同时也为防治股骨头坏死开辟新途径。但川芎嗪还具有扩张血管、抑制血小板聚集、改善组织微循环、调节脂质代谢、抗脂质过氧化、抑制自由基产生、抗组织纤维化和钙离子阻断等作用。川芎嗪治疗股骨头坏死可能是多种作用综合的结果，尚有待进一步更为深入的研究。另外在川芎嗪用药剂量、用药时间、给药方式上也仍需探索。

参考文献

[1]LiG,WhiteG,ConnollyC,ela1.Cellproliferationandapoptosisduringfracturehealing[J].JBoneMinerRes,2002,17(5):791～799.

[2]熊明月,王坤正,党晓谦.早期激素性股骨头坏死骨细胞凋亡的研究[J].中国修复重建外科杂志,2007,21(3):262～265．

[3]郭坤亮,安洪,蒋电明.内源性糖皮质激素在酒精性股骨头缺血坏死骨细胞凋亡中的作用[J].酿酒科技,2009(6):47～49.

[4]SatoM,SuganoN,OhzonoK,etal.Apoptosisandexpressionofstressprotein(ORP150,HO1)duringdevelopmentofischaemicosteonecrosisintherat[J].JBoneJointSurgBr.2001,83(5):751～759.

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[6]吴涛,李天晓,王志学等.靶动脉及静脉药物治疗股骨头坏死68例临床疗效分析[J].中华全科医学,2012,10(4):556～557.