缺氧环境下川芎嗪对人肝癌HepG2细胞突变型p53蛋白表达的影响

缺氧环境下川芎嗪对人肝癌HepG2细胞突变型p53蛋白表达的影响

邢国辉1韩培香2张加军1李艳萍1张立辉1

邢国辉1韩培香2张加军1李艳萍1张立辉1

（1日照市中医医院山东日照276800；2五莲县叩官中心卫生院山东日照262305）

【中图分类号】R730.52【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）27-0040-01

【摘要】目的探讨缺氧环境下川芎嗪对体外培养的人肝癌HepG2细胞突变型p53蛋白表达的影响。方法用氯化钴(CoCl2)创造缺氧微环境，设常氧组、缺氧组及缺氧加药物组，用免疫细胞化学法观察川芎嗪作用HepG2细胞48h后突变型p53蛋白表达的影响。结果常氧环境下突变型p53蛋白呈弱阳性表达，缺氧诱导48小时后突变型p53蛋白表达显著升高（t=283.42，P<0.05），缺氧环境下川芎嗪能抑制突变型p53蛋白的表达（t=407.63，P<0.05）。结论缺氧环境下川芎嗪能抑制突变型p53蛋白的表达。

【关键词】缺氧川芎嗪肝癌细胞p53

川芎嗪(tetramethypyrazine，TMP)是从中药川芎中提取的生物碱，它具有多种生物学活性，文献报道川芎嗪具有抗多种恶性肿瘤的作用[1,2]，近年来研究发现，缺氧环境下川芎嗪能抑制肺癌等肿瘤细胞增殖[3]，但对肿瘤细胞作用的相关机制报道不多。为此，本研究以化学缺氧剂氯化钴（CoCl2）模拟缺氧微环境，通过观察川芎嗪对人肝癌HepG2细胞突变型p53蛋白表达的影响来探讨其抗肿瘤机制，为川芎嗪应用于临床治疗肝癌提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料人肝癌HepG2细胞株购自山东省医学科学院。川芎嗪注射液购自黑龙江哈尔滨医大药业有限公司。DMEM培养基购自美国Gibco公司。CoCl2购于美国Sigma公司。胎牛血清(杭州四季青)、PV-9000免疫组化试剂盒及鼠抗人c-myc单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养取指数生长期的人肝癌细胞株HepG2接种于含100mL/L胎牛血清、青霉素、链霉素各l×105U/L的DMEM培养液中，置于37℃，50mL/LCO2培养箱内常规传代培养。

1.2.2缺氧培养条件预先在常氧环境下培养，待细胞贴壁进入对数生长期后加入化学缺氧剂CoCl2，其终浓度为150μmol/L，置于37℃，50mL/LCO2培养箱内常规传代培养。

1.2.3免疫细胞化学法观察缺氧环境下HepG2细胞突变型p53表达：取对数生长期的HepG2细胞制成2×108/L的细胞悬液，每孔0.5mL，加入放有盖玻片的24孔板内，设常氧对照组、缺氧对照组和缺氧下川芎嗪组，待细胞贴壁后分别加入CoCl2和川芎嗪（终浓度4.0umol/L），48h后取出细胞爬片，冷丙酮固定5min，PBS冲洗，按PV-9000试剂盒步骤检测突变型p53，DAB显色，脱水，透明，中性树胶封片。用已知阳性的乳腺癌切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定：突变型p53阳性结果为细胞核内有棕黄色颗粒出现。采用HPAIS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统，检测突变型p53阳性细胞的平均吸光度值(A值)，以间接反映突变型p53阳性蛋白的表达量，并取其均值。

1.3统计学方法

数据用±s表示，组间比较用t检验，用SPSS16.0统计软件分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

缺氧环境下川芎嗪对HepG2细胞突变型p53表达的影响免疫细胞化学法显示：常氧环境下突变型p53蛋白呈弱阳性表达，加入CoCl2创造缺氧微环境诱导48h后突变型p53蛋白表达显著升高（t=283.42，P<0.05），缺氧环境下4.0umol/L川芎嗪作用细胞48h后，突变型p53蛋白表达明显降低，与缺氧对照组比较有统计学意义（t=407.63，P<0.05）（表1）。

表1缺氧环境下川芎嗪作用HepG2细胞48h后突变型p53蛋白的表达

注：与常氧对照组比较▲P<0.05，与缺氧对照组比较﹡P<0.05

3讨论

原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。目前，肝癌的治疗仍主要是以手术为主，结合辅助化疗等综合治疗，但是肿瘤缺氧微环境的存在成为肿瘤化疗失败的重要原因[4]，因此，寻找抗肿瘤的有效靶向药物及相关机制成为研究的热点问题。目前川芎嗪抗肿瘤的作用日益受到重视，文献报道川芎嗪具有抗多种恶性肿瘤的作用[1,2]，近年来研究发现，缺氧环境下川芎嗪能抑制肺癌等肿瘤细胞增殖[3]，但其对抗肿瘤的相关机制报道不多。

本研究通过川芎嗪对缺氧模拟剂氯化钴(CoCl2)培养的人肝癌HepG2细胞的干预作用，观察川芎嗪对突变型p53蛋白表达的影响，以探索其抗肝癌的相关机制。p53是人类恶性肿瘤中最常见的突变基因之一。人类约50%的肿瘤p53发生突变，多种肿瘤组织一旦发生p53突变，其功能失活，不仅丧失了抑癌功能，同时突变型p53还具有癌基因活性，具有促进细胞恶性转化的作用[5]。研究显示，缺氧环境下突变型p53蛋白表达较常氧下明显升高（P<0.05），而川芎嗪在缺氧环境下对HepG2细胞的干预使突变型p53蛋白表达显著降低，与缺氧对照组比较有统计学意义（P<0.05），说明川芎嗪可以通过抑制突变型p53蛋白表达。研究发现，在缺氧环境下突变型p53蛋白在HepG2细胞中表达升高，而川芎嗪可抑制突变型p53蛋白表达[5]。研究结果提示，在缺氧环境下川芎嗪可能通过抑制突变型p53蛋白的表达而发挥了抗HepG2细胞的作用。川芎嗪的这种作用有可能成为抗肿瘤的新药，其具体的作用机制有待进一步探索。

参考文献

[1]舒敬德,杨君,蒋国勤等.川芎嗪对乳腺癌细胞株MDA-MB-231增殖及凋亡的影响[J].肿瘤学杂志,2011,17(2):133-135.

[2]韩娇艳,朱方强,徐祥川等.芎嗪通过Akt信号通路影响前列腺癌PC3细胞的增殖和凋亡[J].第三军医大学学报,2013,35(2):105-108.

[3]胡家才,李清泉.川芎嗪对低氧时肺癌A549细胞缺氧诱导因子－1α表达的影响[J].湖北中医药大学学报,2011,13(4):15-17.

[4]ShannonAM,Bouchier-HayesDJ,CondronCM,etal.Tumourhypoxia,chemotherapeuticresistanceandhypoxia-relatedtherapies.CancerTreatRev.2003;29(4):297-307.

[5]SigalA,RotterV.TheOncogenicActivityofp53Mutants.in:Thep53TumorSuppressorPathwayandCancer,editedbyZambettiSpringer[M].ScienceBusinessMedia,NewYork,2005:199-223.