中西药联合逆转多重耐药铜绿假单胞菌抗菌活性研究

中西药联合逆转多重耐药铜绿假单胞菌抗菌活性研究

房华汪瑞忠张晓雪

（上海健康医学院附属浦东新区人民医院检验科上海201299）

【摘要】目的：研究中西药联合逆转耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌（MDR-PA）抗菌活性作用，为临床中西药结合治疗MDR-PA感染提供依据。方法：赤芍、五倍子、野菊花、鱼腥草、小檗碱，煎煮法制备提取液，采用两倍稀释法观察中药对细菌的抑菌效果；采用K-B法检测中草药对多重耐药细菌及原始菌株的最低抑菌浓度，评估中草药逆转多重耐药菌耐药性的效果；采用棋盘格稀释法测定中西药的MIC，并计算联合抑菌指数（FIC）。结果：五种中药对MDR-PA有不同程度抑菌作用，五倍子对MDR-PA抑菌效价在512～1024之间，抑菌作用最强；五倍子与小檗碱可以显著逆转MDR-PA的耐药性（P<0.05）；亚胺培南的药物浓度平均降低至原来2/3，小檗碱的药物浓度从275mg/ml平均降到20.80mg/ml（P<0.01）；头孢他啶与五倍子联合，头孢他啶与五倍子药物浓度平均降低至原来浓度1/2(P<0.05)。结论：五倍子与小檗碱可以逆转MDR-PA的耐药性，亚胺培南与小檗碱、头孢他啶与五倍子联合可以增加各自对MDR-PA抗菌作用的敏感性。

【关键词】中西药联合；多重耐药铜绿假单胞菌；耐药性逆转；协同作用

【中图分类号】R453【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2017）29-0389-03

随着广谱抗菌药在临床的广泛使用，多重耐药菌不断出现，已成为临床感染治疗的难题。为了研究中草药对多种耐药菌的抗菌及逆转细菌耐药性作用，本文选取相关文献[1,2]中报道对铜绿假单胞菌抑菌作用较好的五种中药，与多重耐药菌铜绿假单胞菌（MDR-PA）进行了体外抑菌及逆转细菌耐药性试验，现报道如下。

1.材料与方法

1.1实验菌株

菌株来源2015年5月—2016年12月临床分离鉴定菌株：多重耐药铜绿假单胞菌（MDR-PA）30株（剔除重复分离菌株），MDR菌株参照文献[3]判断标准。

1.2中药水煎剂

赤芍、五倍子、野菊花、鱼腥草（购自养和堂药房），小檗碱（粉剂，中国药品生物检定所）。

1.3方法

中草药抗菌实验采用中草药抗菌实验试管法，逆转细菌耐药性实验采用K-B法，联合药敏试验采用棋盘格法，分别按参考文献[4，5]进行。

1.3.1中药原液的制备

分别称取上述中药50g，按5倍量加入蒸馏水浸泡，100℃30min将两次加热过滤，滤液加热浓缩至50ml，生药含量为1g/ml；小檗碱配制成1g/ml；调节PH为7.6，离心后留取上清，进行高压灭菌，4℃冰箱保存备用。

1.3.2药液的倍比稀释与加菌

采用2倍稀释法，使1～10管含有倍比稀释的药液即1:2，1:4，1:8等系列药液。MDR-PA菌株用生理盐水调到0.5麦氏浓度（1.5×108CFU/ml）,稀释30倍，向两倍稀释好的药液的1～11支试管加100μl菌悬液，最终接种量为5×105CFU/ml，第十一管为阳性对照管，第十二管不加菌为阴性对照管。

1.3.3中草药抗菌实验结果判读

35℃孵育18～24h后观察，抑制检测菌肉眼可见的生长的最低药物浓度为测定药物对检测菌的最低抑菌浓度，阳性对照组长菌需呈浑浊状，阴性对照管需呈清晰状。

1.3.4逆转细菌耐药性试验

将五种中药原液配制成低于最低抑菌浓度的药液，挑取MDR-PA于各药液中，35℃培养18～24h后，使用生理盐水离心洗涤配制成0.5麦氏浓度菌液，MH平板上用K-B法做药敏试验，同时做原菌株药敏试验作为阴性对照，比较逆转前后抑菌圈直径变化。

1.3.5中西药联合药敏试验

联合药敏试验采用棋盘格微量稀释法检测药物的联合作用，采用9个稀释度，药物最高浓度为其MIC的4倍，依次倍比稀释为1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256倍浓度，两种药物分别在96孔培养板上按纵列和横列进行联合。接种菌量为5×105CFU/ml，35℃孵育18～24h后观察结果。计算联合药敏指数（FICI,fractionalinhibitoryconcentrationindex）判断联合药敏效果。

2.结果

2.1中药单药作用

五种中药对MDR-PA不同程度抑菌作用，抑菌效价为五倍子512～1024，鱼腥，32～64，野菊花8～16，赤芍4～8，小檗碱2～4。五倍子抑菌作用强弱顺序为五倍子>鱼腥草>野菊花>赤芍>小檗碱。

2.2五种中草药对多重耐药菌逆转细菌耐药性结果，见表1。

2.3五种中药与头孢他啶、亚胺培南、环丙沙星进行联合药敏试验。

亚胺培南与小檗碱联合效果最佳，18株协同，12株相加；头孢他啶与五倍子联合有9株协同15株相加；环丙沙星与五种中草药联合显示无关作用；三种抗生素与五种中草药联合均无拮抗作用。

2.4具有协同作用药物组合单独与联合使用情况下MIC比较

具有协同作用药物组合单独与联合使用情况下MIC的比较采用t检验，两者存在显著性差异（P<0.05）。见表2。

3.讨论

随着广谱抗生素碳青霉烯类药物在临床广泛及不合理应用，多重耐药菌不断增加甚至出现泛耐药菌株[5]。新药的研发速度远跟不上细菌耐药的速度，加之很多抗生素有很大的毒副作用，给临床抗感染治疗带来极大困难[6]。中药抗菌作用有着悠久的历史，近年来的研究已经表明，中药的确有抗菌、延缓、消除细菌耐药性的作用[7,8]。为了发挥中西药在抗菌治疗方面的各自优势，本课题从中西药联合使用角度来探索治疗多重耐药铜绿假单胞菌方法。

五种中药提取物对MDR-PA均具有一定抗菌作用，其中五倍子抗菌效果最好，抑菌效价达到215～1024，抑菌强弱：五倍子>鱼腥草>野菊花>赤芍>小檗碱；五倍子与小檗碱对MDR-PA逆转前后比较统计学上有显著性差异。中药能够逆转细菌耐药性的效果是明确的[9]，如果能够使MDR-PA部分或全部恢复对抗生素的敏感性，对临床治疗多重耐药菌感染具有重要意义。

从中西药联合药敏试验结果上看，亚胺培南与小檗碱、头孢他啶与五倍子有较好的联合效果，显著降低各自抗菌药物使用浓度。环丙沙星与五种中草药联合显示无关作用；三种抗生素与五种中草药联合均无拮抗作用。发挥中西药联合使用在对抗细菌抗药性方面的优势是目前抗菌治疗的新的方向。中药的水煎液与含药血清与抗生素联合使用均有较好的效果，如石庆新等，发现中药联用可以大大提高亚胺培南对耐药菌的抑菌和杀菌作用[10]，这与本研究结果基本一致。临床实践中，中西药联合治疗疾病的例子有许多，如肾盂肾炎[11]、盆腔炎[12]等的治疗，这也间接证明本研究中西药联合治疗多重耐药铜绿假单胞菌感染的可行性。

总之，随着科学技术的进步，中药活性成分的提取物也得到迅速发展。提高中草药活性成分的抗菌效价，中西药联合必将在抗菌治疗方面得到长足发展。

【参考文献】

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基金项目：上海市卫生和计划生育委员会资助课题（编号201440066）