血府逐瘀胶囊调节hsa-miR-378a-5p表达研究及生物信息学分析

血府逐瘀胶囊调节hsa-miR-378a-5p表达研究及生物信息学分析

林凡1张云2黄慧珍1高冬1

（1福建中医药大学中西医结合学院福建福州350122）福建教育学院福建福州350000）

【摘要】目的：分析hsa-miR-378a-5p在血府逐瘀胶囊调节内皮细胞血管新生中的表达及作用机制。方法：应用Q-PCR方法分析药物对人微血管内皮细胞（HMEC-1）对hsa-miR-378a-5p表达的影响；进而利用4个miR数据库预测其靶基因并取交集，从OMIM数据库中获取血管新生相关基因；利用Cytoscape软件构建“hsa-miR-378a-5p靶点-人类蛋白数据库”、“血管新生相关基因-人类蛋白数据库”蛋白质相互作用网络，分析上述网络的拓扑结构及重合度；对hsa-miR-378a-5p可能影响的血管新生相关基因进行GO功能和KEGG通路注释分析。结果：血府逐瘀胶囊可促进HMEC-1中hsa-miR378-5p的表达，该miR可能通过GNAQ、CREB1等靶基因调节VEGF等信号途径参与这一过程。

【关键词】血府逐瘀汤；血管新生；hsa-miR-378a-5p；生物信息学分析

【中图分类号】R243【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2018）36-0080-03

血管新生（angiogenesis）是在已有血管基础上通过动员诱导内皮祖细胞分化为内皮细胞（endothelialcells，ECs），随后ECs增殖、迁移、黏附等过程生成新血管的过程。在血管异常增生性疾病（如糖尿病、肿瘤）和缺血性疾病（如心肌梗死、脑梗死、冠心病）发生、发展和治疗中，调节疾病相关的血管新生是研究热点之一[1]。血府逐瘀汤为活血化瘀经典方，血府逐瘀胶囊为该方剂常用中成药，在临床上可用于冠心病、糖尿病等血管新生相关疾病的治疗。研究显示，其可适度促进ECs的血管新生[2]。微小RNA（microRNA,miR）是体内基因表达调控的一类重要分子。研究表明，ECs中表达的miR378参与血管新生的调节[3]。血府逐瘀胶囊是否影响ECs中miR378表达，后者在血管新生过程中如何作用？这些问题尚不明确。

本研究以人微血管内皮细胞（HMEC-1）为材料，分析血府逐瘀胶囊对hsa-miR-378a-5p表达的影响，采用生物信息学方法分析该miR成熟体在血管新生过程中的可能机制，以期为深入研究血府逐瘀汤调控血管新生机制提供理论参考。

1.材料与方法

1.1细胞株及含药血清

HMEC-1细胞由本实验室保存；含药血清的制备参照文献3所述，血府逐瘀胶囊由天津宏仁堂药业有限公司生产，主要成分为当归、生地黄、炒桃仁、红花、麸炒枳壳、赤芍、柴胡、甘草、桔梗、川芎和牛膝。

1.2试剂及设备

MCDB-131培养基和胎牛血清（FBS）购自美国Gibio公司，miRNeasyMiniKit(217004)购自Qiagen公司，miRNAcDNA第一链合成试剂盒（KR201）、miRNA荧光定量检测试剂盒（FP401）、hsa-miR-378a-5p检测引物（CD201-0584）和内参U6(CD201-0145)引物购自天根生化科技（北京）有限公司，其余试剂均为国产分析纯；CO2培养箱为德国Heraeus公司生产，荧光定量PCR仪(CFX96Touch)产自美国Biored公司。

1.3Q-PCR分析血府逐瘀胶囊对HMEC-1细胞hsa-miR-378a-5p表达的影响

HMEC-1细胞进行常规培养，收集对数生长期细胞经同步化处理后随机分为处理组与对照组。处理组加2.5%含药血清处理，以2.5%空白血清处理为对照。给药处理48h后，收集细胞并参照试剂盒说明书所述方法提取RNA并逆转录为cDNA；采用95℃15min,94℃20s，60℃35s，40个循环，以U6为内参进行Q-PCR检测。

1.4生物信息学分析

综合运用miRanda、miRDB、Pictar2和Targetscan等常用数据库预测hsa-miR-378a-5p靶基因，取交集作为后继分析的基因集合。从OMIM（https://www.omim.org/）数据库中检索得到血管新生相关基因，并从HPRD（http://www.hprd.org/）数据库中获取人类蛋白数据库作为背景网络。随后用Cytoscape3.2.1软件分别以预测的靶基因和血管新生相关基因构建“hsa-miR-378a-5p靶点-人类蛋白数据库”、“血管新生相关基因-人类蛋白数据库”蛋白质相互作用网络，分析各节点的度值和两个网络的重合度。最后利用David数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对在两个网络中重合基因进行功能注释（geneontologyanalysis，GO）和京都基因与基因组百科全书（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）生物通路数据分析，以P＜0.05为界值。

1.5统计学方法

采用SPSS22.0进行分析，采用2-△△ct法分析目的基因的表达，实验数据采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1血府逐瘀胶囊促进HMEC-1细胞hsa-miR-378a-5p的表达

与2.5%空白血清对照组相比，2.5%含药血清处理细胞48h可以显著提高hsa-miR-378a-5p的表达水平（图1）。

注：与2.5%空白血清对照组相比较，**P＜0.01，n=3

图1血府逐瘀胶囊对HMEC-1细胞hsa-miR-378a-5p表达的影响

2.2靶基因预测结果

利用4个miR数据库进行靶基因预测，分别得到7154、791、247和12942个靶基因，取4个库共同预测的11个为候选靶基因（表1）。

2.3预测靶基因的生物信息学分析

将11个候选靶基因构建“hsa-miR-378a-5p靶点-人类蛋白数据库”蛋白质互作（PPI）网络（图2）。该网络包括250个节点，其中度值最高节点为预测靶基因ATXN1(度值154)，其次为G蛋白αq亚基（GNAQ，度值40）和环磷酸腺苷应答元件结合蛋白（CREB1，度值38）。

图2“hsa-miR-378a-5p靶点-人类蛋白数据库”PPI网络

为分析这些蛋白与血管新生关系，获取血管新生相关基因并构建“血管新生相关基因-人类蛋白数据库”PPI网络，并对比2个PPI网络。结果二者这间存在50个重复节点，占hsa-miR-378a-5p靶点互作蛋白总数的25%，提示该miR可能通过这50个蛋白调节ECs细胞的血管新生。50个重复节点中包括GNAQ和CREB1两个高度值的靶基因，提示它们可能是该miR调节血管新生的关键靶点。利用DAVID平台对上述结果进行GO富集分析，结果筛选出35个条目（P＜0.05），可聚集成7类。其中涉及生物过程有18条，包括蛋白磷酸化、胞内信号转导、RNA转录等；涉及分子功能有13条，包括蛋白激酶活性、ATP结合、RNA转录起始、泛素蛋白连接酶结合等；涉及细胞组成有4条，涉及核染色质、质膜、膜筏、黏着斑等（表2）。进行KEGG通路注释分析，筛选出显著54条通路（P＜0.05），其中包括VEGF信号、黏附斑、细胞周期、PI3K-Akt、ErbB信号、mTOR信号等血管新生信号途径（表3）。

3.讨论

miR在广泛参与血管新生的各种过程。一些研究表明，miR-378可通过促进细胞迁移，侵袭和血管新生在肿瘤的发生、转移中起重要作用，如非小细胞肺癌[5]、卵巢癌[6]。血府逐瘀汤出自清代王清任的《医林改错》，为活血化瘀的代表方之一。多项研究表明血府逐瘀汤可适度调节血管新生，具有多组分、多靶点、多途径的作用特点。本研究在前期miR测序基础上，通过Q-PCR方法证明血府逐瘀汤可促进HMEC-1中hsa-miR-378a-5p的表达，提示其可能参与了血府逐瘀汤调节ECs血管新生的过程。

miR大多具有复杂的调控功能，利用生物信息学方法进行分析，为后继实验验证提供有力的资料是常用策略。hsa-miR-378a-5p靶基因预测筛选出11个候选基因，PPI网络分析结果表明GNAQ和CREB1两个靶基因与人体较多蛋白质具有互作关系。其中GNAQ编码Gα（q）亚基,是G蛋白信号调节途径的中心结构，参与多种细胞信号转导过程，其突变可导致先天性血管瘤发生[7]。CREB1参与氧诱导的视网膜新生血管，可能调节PI3K/Akt及VEGF-A信号[8]。GO和KEGG通路分析结果提示，hsa-miR-378a-5p可能通过调节细胞蛋白磷酸化水平，通过影响VEGF信号、黏附斑、PI3K-Akt、ErbB信号等血管新生信号途径参与血管新生的调节。其中VEGF参与血管新生全过程，联系PI3K-Akt、mTOR等信号通路，作用关键。前期研究亦表明血府逐瘀汤可调节ECs中VEGF的表达，进而调节血管新生[3]。

综上所述，血府逐瘀汤调节HMEC-1细胞中hsa-miR-378a-5p表达；该miR可能作用于GNAQ、CREB1等基因，通过调节VEGF等信号途径参与这一过程。

【参考文献】

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