线粒体功能的体外评价方法

线粒体功能的体外评价方法

黄红艳

黄红艳（靖江市人民医院柏木分院检验科江苏泰州214500）

【摘要】线粒体一直被认为是细胞能量生产和代谢工厂，正常的线粒体功能是维持器官的正常功能和细胞稳定的重要因素之一，对于需要高能量代谢的骨骼肌和心肌尤为重要。线粒体相关疾病的形成及其分子生物学诊断需要临床和实验室的检测。线粒体疾病的基因双重性，多器官系统特征以及广泛的可识别表型是目前临床诊断所面临的挑战。为了克服这些临床诊断障碍，实验室对线粒体多方面的评价可以提供相对充足的证据，包括血液学，组织化学分析手段，神经影像分析，刺激实验检测，组织和细胞的酶学分析以及DNA检测(MancusoM.,2009)。本文就线粒体的功能性评价方法作以下综述，为临床线粒体相关疾病的诊断提供可行的方法学手段。

【关键词】线粒体呼吸链功能评价

【中图分类号】R329【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）01-0130-02

1.活性氧族(ReactiveOxygenSpecies)的产生在细胞内，线粒体是超氧离子（O2-）和其他活性氧族的主要来源，病理情况下，通过异常的氧化反应，线粒体产生约85%的超氧离子(BoverisandChance,1973;Dr?ge,2002).在线粒体复合体间的电子转运过程中，约2-5%的离子逃逸并释放O2，导致了O2-在复合体I到复合体III中的产生，由于线粒体活性增强或呼吸链的抑制作用，氧离子会显著的增加导致了氧化损伤，这可能是脑神经退行性病变发病的机理之一。活性氧族ROS的生理功能与脑神经元的代谢活性息息相关，过多的ROS会导致线粒体功能异常及神经损伤。例如，在脑缺血和再灌注过程中，细胞间液中过多的ROS会产生氧化应激，氧化平衡被打破，从而导致细胞性的直接或间接的损伤(Leietal.,1998)。因此，检测ROS的产生和分布可以从一方面评价线粒体的功能。

目前有很多ROS的标记物，如广泛应用的二氢氯荧光素dichlorodihydrofluorescein(LeBeletal.,1992)，及其各种衍生物如二氢溴乙非啶（Het）(Gallopetal.,1984)，和二氢罗丹明dihydrorhodamine(Duganetal.,1995)。细胞膜渗透型二氢二氯荧光素（H2DCFDA）可通过被动转运进入细胞内，一旦其醋酸基团被细胞内酯分解，就可被氧化成具有荧光的二氯荧光素。二氯荧光素对周围环境氧的水平十分敏感，可进一步被氧化而呈现可见光。其羧化类似物H2DCF能够延长在活细胞内的停留时间(Hempeletal.,1999)。而其另一种具有硫醇反应活性的氯甲基团衍生物能够绑定细胞内的硫醇残基而延长在细胞内的停留时间(KirklandandFranklin,2001)。这些ROS标记物的不足之处是缺乏对ROS的特异性。目前，一种对氧化还原敏感的重组体绿色荧光素已经被应用，它具有两种不同的最大吸收波长，并且这两种吸收波长彼此间互不干扰(Hansonetal.,2004)，以保证对ROS具有更广更稳定的动力学反应性，并可用于实时监测细胞内的氧化还原状态(CannonandRemington,2006)。这些重组荧光蛋白的另一个优点是，它们可以被选择性地针对各种细胞器或结构，如线粒体，细胞核和质膜(Dooleyetal.,2004)。

2.线粒体膜电位的检测

线粒体膜电位的产生依赖于线粒体复合物Ⅰ，Ⅲ，和IV呼吸链所产生的线粒体内膜质子梯度。各种各样的荧光团可用于监测线粒体膜电位，最常用的是Rh123及其衍生物TMRM.当Rh123能聚集在线粒体内时，能使529nm激发光淬灭，当Rh123从线粒体释放进入胞液的时候，能使激发荧光增强(Baharetal.,2000;Duchen,1999;Emausetal.,1986)。因此，当线粒体膜电位下降的时候，被标记细胞的细胞液荧光将会显著增强。TMRM荧光同样能随着线粒体膜电位的改变而改变。目前的实验表明，Rh123的衍生物JC-1对于线粒体膜电位的改变更为敏感,并且在标记JC-1的同时细胞组织的完整性不会被破坏，这也使得JC-1能够应用于免疫组化。值得注意的是，这些细胞膜渗透性染料能够通过所有的脂质体膜，并不仅仅穿过线粒体膜或其他组织，还能穿过质膜，最终染料将大量堆积在线粒体基质(KerrDS.2010)。这些淬灭模式检测线粒体的荧光是一种非线性的，因此无法准确量化单个细胞中线粒体膜电位的变化，很难比较线粒体膜电位变化的绝对值，但在组织水平，可以准确测定线粒体膜电位的动力学改变(ScandurraFM,2010)。因此，染料和线粒体模型的选择取决于实验的目的，例如选择单细胞或离体线粒体。

3.NADH和黄素蛋白的自体荧光

在线粒体电子链中，NAD+和NADH是氢离子的载体并与氧化还原反应密切相关。NADH是细胞质和线粒体氧化还原状态的一个指示剂，而黄素蛋白是酶的辅助因子，也与氧化/还原反应相关(MayevskyA,2009)。NADH与FAD的荧光吸收强度与线粒体呼吸链相关(ChanceandWilliams,1955)。NADH荧光常用于体外特定条件的测定，如扩散性抑制和缺血。最近的报道显示，NADH荧光在脑皮层中动脉的影像可通过CCD镜头捕获(Strongetal.,2000)。目前有很多量化NADH和黄素蛋白的方法，双波长光谱测定法常用于离体线粒体的测定。另外，氧化还原荧光测定法通过摄谱仪的二极管线性分析也被广泛应用于缺血低氧状态下NADH的测定(Gerichetal.,2006;Heppetal.,2005)。

4.线粒体代谢的光测定法

线粒体呼吸链的某些元件根据其氧化状态可以吸收不同能量的光，因此量化吸收带光的强度并比较他们的非敏感波长可以监测单个呼吸链复合体的相对活力。与以上的染料测定法相比，这种方法的优点是不存在染料测定时的染料上样量，染料区分，图像漂白等问题，并且这种方法可以直接评价单个呼吸链复合体的功能(MillsandJ?bsis,1972;Strelleretal.,2002)，。例如，细胞色素C的光吸收可用于测定组织在不同生理调件下的氧利用率，且光吸收的误差比染料指示剂测定法低很多，从而提高了精准度。

5.ATP含量测定

线粒体呼吸链为细胞提供了绝大部分的ATP，因此细胞ATP的水平能反映线粒体功能状态。细胞ATP含量的测定有多种光学测定方法，例如基于荧光或吸收测定的核磁共振或高效液相色谱。荧光素或荧光酶ATP检测是最常用也是最灵敏的技术。ATP所依赖的荧光素氧化酶伴随着光子的激发，激发出的光子依靠自身的化学反应发光，而ATP是其限制因子，因此检测生物发光强度可以衡量ATP的含量(Bowersetal.,1993)。另一种ATP检测方法是通过测定己糖激酶与葡萄糖磷酸脱氢酶反应中NADP的减少量。但是这种检测方法需要组织匀浆，不能动态连续的监测细胞内的ATP水平。第三种光学检测是同过检测细胞内与ATP绑定的Mg2+的浓度。当ATP水解成ADP时，这种绑定会解离，所以Mg2+的增加意味着细胞溶质中ATP含量的降低(DumontM,2011)。以上这些检测方法的应用能使我们进一步了解神经元代谢过程中的质子反应过程。

6.线粒体Ca2+的检测

线粒体中Ca2+的水平对线粒体的代谢活性和细胞内钙离子平衡的调节起着至关重要的作用。钙离子的动态可以用光学影像来评价，并能反映线粒体的功能。生理情况下，线粒体内维持着低钙水平，尽管线粒体内膜不能自由渗透离子，但钙离子可通过Na+/Ca2+交换运出细胞并对抗增加强的电化学梯度。

线粒体对钙离子的摄入发挥多种生物学功能。例如，生理条件下的钙离子水平的波动能调节ATP的产量以及激活柠檬酸循环。当线粒体内钙浓度增加时，钙离子的摄入会干扰线粒体功能，激活mPT和细胞死亡信号通路，如细胞凋亡或坏死。钙离子的在线粒体内的堆积同时能导致ROS的生成，线粒体膜电位去极化等(Bindokasetal.,1998;Carriedoetal.,2000)。

另外，线粒体钙离子还可通过图像测定。细胞可渗透型罗丹明（Rhod-2）目前是监测线粒体内钙离子浓度最好的标记物。但是选择性装载Rhod-2需要特定的装载条件，因为残留在细胞溶质中的Rhod-2会干扰钙离子水平的监测。此外，还可以用Rhod-2与细胞溶质钙离子的指示剂，如fluo-1,indo-1等组合成双染。双染的优点是细胞溶质中的染料将限制在细胞液中，而不会进入线粒体或内质网，残留的Rhod-2就能从细胞中去除从而降低了检测过程中的干扰。

总结

线粒体功能的准确评价是保证临床线粒体相关疾病准确诊断的重要途径。准确的诊断能够最大限度地降低医疗成本，并提供准确的预后和复发的辅助咨询。线粒体的评价方法很多，除了本文所述，还可从PO2，线粒体DNA以及骨骼肌，心肌等不同的器官和细胞水平进行多方位评价。并且，目前有很多线粒体疾病的动物模型，如缺血再灌注模型，早衰小鼠，链霉素诱导的心肌线粒体障碍，Mclk1_/_小鼠等(GrattaglianoI.,2011)，可以从这些动物模型中探究线粒体发病机理和更多可靠的检测方法。对于线粒体功能性评价，本文从线粒体膜电位，钙离子水平等六个方面做一些总结。光学的应用和药理学工具能够为线粒体功能的测定提供更多的空间分布和动态信息，多参数方法评价线粒体功能和功能障碍能够实时监测线粒体功能的动态，为临床线粒体疾病提供可行的治疗和干预措施。

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