全膝关节置换术中止血带应用所致氧化应激的研究

全膝关节置换术中止血带应用所致氧化应激的研究

钱科军徐华中施克勤陶波

钱科军徐华中施克勤陶波

（无锡市第二人民医院骨科江苏无锡２１４０００）

【中图分类号】Ｒ６８７．４【文献标识码】Ａ【文章编号】１５５０－１８６８（２０１４）１１

【摘要】目的探讨全膝关节置换术中止血带应用导致的自由基产生及脂质过氧化，并探讨缺血性预处理缓解再灌注带来的损害。方法本研究以采取椎管内麻醉行全膝关节置换术病人为研究对象。采用止血带前１分钟及松开止血带后５分钟和２０分钟时，抽取研究对象的血。用光泽精化学发光分析法及卵磷脂氢过氧化物测定法分别测出活性氧的量及脂质过氧化的程度。结果本研究发现首次松开止血带后５分钟和２０分钟活性氧（ＲＯＳ）量显著增高；第二次松开止血带后５分钟，活性氧量虽然增高，但第二次灌注后２０分钟恢复正常水平。ＲＯＳ峰值出现在第一次灌注后２０分钟。脂质过氧化没有显著变化。结论虽然松开止血带后ＲＯＳ量显著增高，但就行全膝关节置换术病人而言，缺血性预处理可缓解缺血带致再灌注所带来的损害。

氧自由基释放和白细胞激活在再灌注损害留下病理生理学后遗症中起着关键作用［１］。活性氧的细胞毒性表现在引起细胞膜或血浆脂蛋白中不饱和脂肪酸过氧化，并且活性氧可直接阻断线粒体中呼吸链酶的活性［２］。光泽精化学发光分析法能够发现活性氧的形成过程；发光分析法还能发现发光的的代谢产物，包括原始产物如：超氧阴离子（Ｏ２－）及其他含氧代谢产物如过氧化氢（Ｈ２Ｏ２）、羟基阴离子（ＯＨ－）和次氯酸（ＨＯＣＬ）等。再灌注损害中形成活性氧后，可导致脂质过氧化的形成。脂质过氧化的程度可以丙二醛（ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ，ＭＤＡ）形成的量［３］或是特殊的脂质过氧化产物，卵磷脂氢过氧化物（ＰＣＯＯＨ）的生成量来表示［７］。

在双侧全膝关节置换手术中，止血带的使用和松开通常都是相继进行的，可以导致缺血性再灌注损害。有研究表明，缺血性预处理（ＩＰＣ）有预防上述损害的效果。另外，不同的实验模型表明，缺血性预处理有预防心血管疾病的能力［４］。本实验通过观察自由基的产生，以及病人脊髓麻醉后行双侧全膝关节置换术中使用止血带导致脂质过氧化损伤的情况，旨在探讨止血带的应用是否会导致缺血性再灌注损害。

一、研究对象

在获得医院伦理委员会的批准及患者的知情同意后，我们选取了１２名ＡＳＡＩ－ＩＩ病人，１２名病人全部在双侧全膝关节置换术中采用了止血带，每次止血带松开前１分钟及松开后５分钟和２０分钟采５毫升血。

二、实验方法

１、光泽精化学发光分析法测活性氧（ＲＯＳ）生成量

血样避光并放在冰上保存，并在两小时内测量。活性氧含量测定完全在避光的室内进行。确定本底水平大概１００秒后，取溶在磷酸盐缓冲液（ＰＨ＝７．４）中浓度为０．１ｍＭ的光泽精１．０毫升放入血样中，然后继续检测６００秒，将曲线下面积整合统一，并将其从背景水平中减去算的总化学发光水平［５］。

２、卵磷脂氢过氧化物（ＰＣＯＯＨ）含量的测量

我们采用Ｍｉｙａｚａｗａ［１１］等的方法测量血浆中ＰＣＯＯＨ的含量。我们之所以选择化学发光高效液相色谱法（ＣＬ－ＨＰＬＣ），是因为这种方法对超氧化物比较特异和敏感。实验步骤简单介绍如下：首先从０．５毫升血浆中抽取总的脂质，然后加入三氯甲烷和甲醇的混合液，充分混匀。再次抽取脂质，并收集三氯甲烷层液体。将两次收集到的三氯甲烷液体脱水并蒸发后，剩余的脂质残留物用４０ｕｌ三氯甲烷－甲醇混合物溶解，用作化学发光高效液相色谱法测量用。ＰＣＯＯＨ和细胞色素Ｃ发生反应中，发光氨会发生氧化，从而可用于化学发光法分析。

三、统计分析

实验所得数据用Ｆｒｉｅｄｍａｎ重复测量数据的秩方差分析进行统计学检验，并应用Ｓｔｕｄｅｎｔ－Ｎｅｗｍａｎ－Ｋｅｕｌｔｓ方法进行多重比较，Ｐ＜０．０５，差异有统计学意义。

四、实验结果

图１显示了活性氧的产生量。在手术中第一次松开止血带后５分钟和２０分钟及在手术中第二次松开止血带５分钟后，全血中活性氧产生量显著增高；但是在第二次血液灌注后２０分钟内，活性氧含量恢复到正常水平。ＲＯＳ的生成量在血液第一次灌注后２０分钟后达到最大。本研究显示血浆中ＰＣＯＯＨ含量变化没有统计学意义。

五、讨论

实验过程中发现全膝盖置换手术过程中，序贯应用止血带能产生活性氧，而缺血性预处理对活性氧的产生有影响。我们以前的研究表明单侧腿部手术导致血液灌注５分钟后ＲＯＳ产生量显著增高，２０分钟后，ＲＯＳ生成量达到最大［２］。本实验中第二次血液灌注后ＲＯＳ生成量快速下降，２０分钟后ＲＯＳ产生量恢复到正常水平；在我们的研究中，初始ＲＯＳ产生量是以光泽精化学发光分析法测得的，而过氧化损害的程度是以ＰＣＯＯＨ产生量的多少来衡量的。

缺血后再灌注造成的损害是许多医药领域中关于死亡率和病死率内容的主要来源。缺血性再灌注损害后ＲＯＳ的产生会导致严重的肺部疾病并发症，所以了解自由基的产生与消失，并进一步控制活性氧带来的不良反应非常重要。

参考文献

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